研究背景卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤,临床上缺乏实用的早期预防和治疗手段,约70%的患者在就诊时已为晚期,而且预后较差,2016年统计的5年生存率不到27%;因此美国政府发起的癌症基因组图谱(TCGA)计划将其列为首批研究的三大肿瘤之一。阐明卵巢癌转移、复发和耐药的分子机制,寻找有效的治疗靶点成为提高卵巢癌患者生存率的关键,也是卵巢癌研究面临的重要课题。选择性剪接(Alternative splicing,AS)是指将同一种前体mRNA剪接成多种不同的成熟mRNA剪接变异体,进而产生具有不同结构和功能蛋白质的过程。选择性剪接参与细胞的生长、分化、凋亡等重要生物学过程,与人类遗传病、肿瘤等疾病的发生密切相关。我们利用表达谱结合TCGA数据分析发现在卵巢癌中表达上调的10个通路中剪接体通路排名第一位,进一步利用表达谱分析了 134个主控剪接因子,发现有33个在卵巢癌中表达显著升高。USP39是我们发现的在高级别浆液性癌中显著高表达的剪接因子,查阅文献发现USP39在乳腺癌、肝癌、胃癌、黑色素瘤等多种癌组织中高表达并显著促进肿瘤细胞的生长。USP39作为剪接体复合物的分子之一,参与招募tri-snRNP到剪接体复合物中发挥作用,参与mRNA剪接的调控。USP39在斑马鱼中参与到RB1(Retinoblastoma 1)剪切的调控;USP39通过选择性剪接调控AuroraB的表达而影响U20S细胞的分裂过程。我们前期实验发现USP39在高级别浆液性卵巢癌(high grade serous ovarian carcinoma,HGSOC)组织中高表达,然而USP39在卵巢癌中的生物学功能及作用机制未见报道,USP39通过AS调控的选择性剪接事件及关键下游分子网络需要进一步研究明确。研究目的:本研究拟明确USP39在高级别浆液性癌中的表达及临床意义;研究USP39对卵巢癌细胞的增殖、侵袭等恶性生物学特征的影响;筛选和鉴定USP39调控的选择性剪接事件及下游关键分子。研究方法:利用表达谱芯片分析高级别浆液性癌组织(n=6)、正常输卵管伞组织(n=6)中的差异基因表达;进一步利用生物信息学分析表达谱数据及TCGA数据;Real-time PCR、免疫组化检测正常及浆液性癌组织中USP39的表达。利用逆转录病毒和慢病毒载体构建过表达和敲低USP39的卵巢癌细胞系,利用平板克隆、Transwell、流式细胞术检测细胞周期验证USP39的功能。分析USP39敲低细胞及对照细胞选择性剪接表达谱筛选USP39下游调控的靶基因,并用qPCR进行验证。在过表达和敲低USP39的细胞中检测HMGA2的表达情况,用Northern blot、小基因模型(minigene)等方法研究USP39对HMGA2的调控。研究结果:1、USP39在高级别浆液性癌组织中显著高表达并与患者预后相关我们利用表达谱结合TCGA数据库分析发现在卵巢癌中表达上调的10个通路中剪接体通路排名第一位,进一步利用表达谱分析了 134个主控剪接因子,发现有33个在卵巢癌中表达显著升高。USP39是我们发现的在高级别浆液性癌中显著高表达的剪接因子(表达谱中上调7.3倍,蛋白质组上调3.4倍);TCGA数据分析表明,USP39在高级别浆液性癌(n=585)中明显高于正常组织(n=8)(P<0.0001);qPCR及免疫组化验证也发现USP39在卵巢癌中的表达水平明显高于正常输卵管伞。利用TCGA数据进行预后分析发现,USP39高表达的患者预后较差(P<0.05)。2、USP39促进卵巢癌细胞增殖、侵袭等恶性生物学行为为阐明USP39在高级别浆液性癌中高表达的生物学意义,我们建立了USP39过表达和低表达细胞系,并进行了系列体外实验。平板克隆形成实验结果,过表达USP39的A2780、HO8910细胞的克隆形成数目和大小明显高于对照组,敲低USP39的A2780、SKOV3细胞的克隆形成数目和大小低于对照组;细胞周期分析显示敲低USP39使细胞停留在在Go/G1期,Western blot检测细胞周期相关蛋白发现敲低USP39的细胞p53、p27表达上调,CyclinDl表达下调。以上实验表明USP39能够显著促进卵巢癌细胞的增殖能力。为进一步研究USP39影响卵巢癌细胞的恶性行为,我们进行了Transwell侵袭实验,结果显示过表达USP39的A2780、HO8910细胞的穿壁细胞数目高于对照组,敲低USP39的A2780、SKOV3细胞的穿壁细胞数目低于对照组。随后我们利用Western blot检测了上皮细胞-间质转化(EMT)相关标记物,结果显示过表达USP39的细胞β-catenin、Vimentin、Snail、Slug上调;敲低者结果相反。说明USP39促进卵巢癌细胞的侵袭力和EMT进程。3、USP39调控的选择性剪接事件及关键靶基因利用建立的USP39低表达及对照细胞系进行选择性剪接表达谱芯片分析,发现敲低USP39引起了 2500多个选择性剪接事件的变化,影响最多的选择性剪接方式是盒式外显子,另外还影响到可变的5’端或3’端及内含子保留,而对不相容性剪接几乎没有影响。课题组进一步筛选出剪接指数较高(绝对值大于3),而且在USP39敲低的细胞中表达下调的的肿瘤相关基因进行验证。发现PARP1、ZEB1、HMGA2、RAD51、MDC1基因的表达在USP39敲低细胞中mRNA的表达水平显著降低。4、USP39通过选择性剪接调控HMGA2基因的表达我们以前的研究结果显示HMGA2在卵巢癌中高表达并于患者预后相关,HMGA2显著促进卵巢细胞的侵袭转移能力。因此,我们选择HMGA2做进一步的研究。qPCR及Western-blot结果表明,HMGA2在USP39过表达的细胞中表达升高,在敲低USP39的细胞中表达下降。利用TCGA数据库分析发现USP39和HMGA2相关系数为0.3167,为中度相关(P<0.001)。通过构建Mingene(野生型和突变型载体),共转染Minigene及发现在过表达USP39的293T细胞中HMGA2 minigene M0的转录本发生了改变,USP39过表达会促进短的转录本增多,USP39对HMGA2转录本的调控属于3’剪接位点选择方式,USP39调控HMGA2minigene依赖内含子3的3’剪接位点的强弱。结论1.USP39在高级别浆液性癌组织中显著高表达并与患者预后相关。2.USP39促进卵巢癌细胞增殖、侵袭等恶性生物学行为。3.USP39调控多个选择性剪接事件的变化及关键肿瘤相关基因的表达。4.USP39对HMGA2转录本的调控属于3’剪接位点选择方式,USP39过表达会促进短的转录本增多,并上调HMGA2蛋白的表达。