背景动脉粥样硬化（athcrosclcrosis，AS）是心脑血管疾病的病理基础。研究表明，伴有免疫反应的炎症过程贯穿于动脉粥样硬化的始终。炎性细胞如T淋巴细胞和巨噬细胞在动脉粥样硬化病变的进程中扮演了重要角色。血管内皮细胞、平滑肌细胞及外膜的成纤维细胞和肥大细胞均可作为免疫细胞产生促炎细胞因子。但在动脉粥样硬化疾病的发生和发展中，对其发病分子机制至今尚未阐明。近年来认为免疫应答，在AS的发生发展中起重要作用，特别是晚近对天然免疫在AS中的作用的研究成为新的研究热点。已知人类具有天然和获得性两个免疫识别系统来抵御潜在的有害物质。获得性免疫系统特异性识别环境中存在的独特抗原决定簇。天然免疫是机体抵御微生物的第一道屏障，识别被称为病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）的高度保守抗原域。Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）识别种类繁多的PAMP，属于模式识别受体。目前为止，人类TLR家族至少有10名成员已被发现。不同的PAMP活化人类TLR家族的不同成员。TLR通过与内、外源性配体结合，激发天然免疫和获得性免疫应答，启动促炎因子的释放，导致炎症反应的发生，在炎症反应的信号转导系统中发挥极其重要的作用。实验发现：TLR调控胆固醇代谢、炎症和免疫反应、细胞凋亡、斑块稳定性以及血管重塑等病理过程，而这些贯穿于AS病程始终。因此，本研究认为TLR将为动脉粥样硬化疾病的治疗提供一个新的靶点。虽然近年来国内外学者在TLR4与AS的相互关系研究中已取得很大的进展但仍存在许多重大问题亟待解决：①既然TLR在AS形成和斑块破裂中扮演重要角色，而动脉粥样硬化斑块病变处的巨噬细胞和内皮细胞以表达TLR4为主，能否通过封闭TLR4基因表达阻止AS进程并降低AS斑块的易损性。这构成本课题的主导思想。②目前造成基因失活的方式主要有反义寡核苷酸技术、核酶或核酸技术、三链DNA技术、单克隆抗体等。反义技术虽能抑制“有害”基因的表达而造成基因失活，但由于反义RNA的选择设计难度较大、反义RNA与mRNA的亲和力及其结合的特异性受到结合位点两侧序列的二级或三级结构的影响、反义寡核苷酸的多聚阴离子性质会引起一系列副作用等问题，故反义RNA目前只应用于恶性肿瘤、病毒感染等疾病。三链DNA技术是将脱氧寡核苷酸与双螺旋双链DNA专一性序列结合形成三链DNA，达到阻止基因转录或DNA复制的目的，此脱氧寡核苷酸称为三链DNA形成脱氧寡核苷酸（TFO），这一技术存在稳定性差、半衰期短的缺点，而且TFO必须与同聚嘌呤同聚嘧啶片段结合，而这样的DNA片段在真核细胞中很少。同样，利用单克隆抗体封闭治疗亦存在半衰期短等缺点。能否找寻一种有效的方法对基因进行干预。③针对TLR4的基因干预与药物治疗谁能在炎性信号转导通路和斑块易损性中起“闸门”作用，它们各自的机制如何?因此，本课题率先开展了封闭TLR4基因阻止AS进程，稳定易损斑块的机制研究，并取得了一定研究成果。目的1．建立TLR4基因RNA干扰载体并转染细胞筛选阳性克隆细胞；2．体外对比研究TLR4-RNAi与阿托伐他汀药物干预抑制TLR4基因继而引起细胞生物学行为和相关基因的表达变化，并探讨其机制；3．体外对比观察TLR4-RNAi与阿托伐他汀药物对TLR4信号通路诱导炎症反应的作用，为在体研究提供分子生物学依据；4．动物实验对比研究RNAi与药物封闭TLR4基因对阻止AS进程，降低动脉粥样硬化斑块易损性的作用机制并评估其治疗效果。方法1．RNA小分子干扰表达载体的构建筛选1．1有效封闭TLR4表达的小分子干扰RNA载体的构建设计、合成两对特异性针对TLR4基因的小分子干扰RNA序列，同时设计与人类所有已知基因序列均无同源性的片段作为阴性对照，以pRNAT-U6.1neo为母本，分别构建小分子干扰RNA载体pRNAT-TLR4-1、pRNAT-TLR4-2及对照载pRNAT-Neg，DNA序列测定鉴定重组质粒的正确性。1．2阳性细胞克隆筛选质粒经阳离子脂质体介导分别转染处于对数生长期的ECV304细胞，利用含G418的DMEM培养液筛选阳性克隆。根据转染质粒的不同，分别命名为ECV304-pTLR4-1，ECV304-pTLR4-2，ECV304-pNeg细胞。1．3有效封闭TLR4表达的小分子干扰RNA载体的筛选收集稳定筛选获得的ECV304-pTLR4-1，ECV304-pTLR4-2，ECV304-pNeg及ECV304对照细胞。荧光定量RT-PCR、Western blot分别检测各转染细胞TLR4 mRNA水平、蛋白质水平的表达，筛选有效阻断TLR4表达的小分子干扰RNA载体。2．体外对比研究RNAi与阿托伐他汀抑制内毒素诱导的TLR4表达的机制及逆转炎症反应的效应2．1将细胞随机分成下列4组进行干预：对照组、LPS组、LPS+RNAi组及LPS+阿托伐他汀组；观察各组TLR4基因和蛋白的表达变化，以及引起NF-κB信号通路蛋白的变化，初步探讨基因干预与阿托伐他汀引起其变化机制的异同。2．2将LPS+RNAi组、LPS+阿托伐他汀组选择性加入NF-κB抑制剂（SN50）、PI3K抑制剂（Ly294002）、ERK抑制剂（PD98059）和P38抑制剂（SB203580），深入探讨基因治疗与药物干预调节NF-κB的内在分子机制的的异同。2．3将细胞随机分成下列4组进行干预：对照组、LPS组、LPS+RNAi组、及LPS+阿托伐他汀组；观察不同方法（RNAi与阿托伐他汀）抑制TLR4基因与下游效应因子IL-6（Th-2细胞因子）及IL-10（促使T细胞向T调节细胞发育）产生的关系。同时观察两种不同干预与炎性因子TNFα产生的关系。以次探讨比较基因治疗与药物干预对TLR4诱导免疫反应与炎症反应的逆转效应。3．动物实验对比研究RNAi与药物封闭TLR4基因对阻止AS进程，稳定AS斑块易损性的作用机制并评估其治疗效果3．1小分子干扰腺病毒载体的体外扩增、滴度测定及体外活性检测pSuppressorAd-TLR4，pSuppressorAd-Neg腺病毒感染HEK293细胞，72h后出现明显细胞病变，分别收集培养上清和细胞。反复冻融裂解细胞，收集病毒颗粒。低熔点琼脂糖空斑形成试验测定病毒滴度，并将其作用于小鼠巨噬细胞RAW264.7，荧光定量检测TLR4mRNA表达。3．2 RNAi基因治疗与阿托伐他汀药物治疗ApoE-／-小鼠的实验研究：8周龄ApoE-／-小鼠，予西方饮食（含21％脂肪和0.15％胆固醇）和SPF级饲养10周，并随机分为下列4组（n=27）对照载体组、RNAi组、安慰剂组和阿托伐他汀组。对照载体组：先单纯高脂喂养5周。于五周末将小分子干扰腺病毒Ad-siRNA-Neg经尾静脉注射至小鼠体内，继续高脂喂养5周。RNAi组：先单纯高脂喂养5周。于五周末将小分子干扰腺病毒Ad-siRNA-TLR4经尾静脉注射至小鼠体内，继续高脂喂养5周。安慰剂组：将安慰剂溶于超纯水灌胃10周。阿托伐他汀组：将阿托伐他汀（10mg／kg／d）溶于超纯水灌胃10周。干预10周后处死动物，颈静脉取血检测血胆固醇、甘油三酯、LDL和HDL（禁食8h）。3．3测定血脂、HDL、LDL水平，比较4组小鼠头臂干斑块面积均值；油红O染色分析斑块脂质含量；斑块破裂评价斑块破裂率；易损指数评价斑块易损性；检测斑块内TLR4、SM-actin、MAMO-2等抗原的免疫活性；荧光定量PCR定量分析各组小鼠头臂干TLR4、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α、VCAM-1及MMP-9基因表达变化。结果1．构建质粒pRNAT-TLR4-1，pRNAT-TLR4-2，pRNAT-Neg，经阳离子脂质体介导分别转染ECV304细胞，利用含500ug／mL G418的DMEM培养液筛选获得阳性克隆。ECV304-pTLR4-1细胞TLR4 mRNA表达水平显著低于未转染组ECV304细胞沉默率达61％。TLR4蛋白相对表达强度显著低于未转染ECV304细，沉默率达52％。2．阿托伐他汀作用于ECV304细胞对LPS上调TLR4的影响Western blot结果显示，LPS+阿托伐他汀（1μmol／L，12h）组TLR4蛋白表达较LPS组显著降低（P＜0.05）。LPS+阿托伐他汀（1μmol／L，24h）组TLR4蛋白表达较LPS组显著降低（P＜0.05）。LPS+阿托伐他汀（1μmol／L，12h）组与LPS+阿托伐他汀（1μmol／L，24h）组TLR4蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。Western blot结果显示，阿托伐他汀预处理细胞，TLR4蛋白表达呈量效依赖性降低。LPS+阿托伐他汀（1μmol／L）组TLR4蛋白表达较LPS组显著降低（5.56±0.26 vs 111.20±1.93），LPS+阿托伐他汀（10μmol／L）组TLR4蛋白表达较LPS组显著降低（4.72±0.22 vs 111.20±1.93），LPS+阿托伐他汀（1μmol／L）组TLR4蛋白表达较LPS+阿托伐他汀（10μmol／L）组差异无统计学意义（P＞0.05）。3．TLR4小分子干扰RNA与阿托伐他汀干预细胞对LPS-TLR4诱导NF-κB活性的影响ELISA结果显示，与对照组相比（0.67±0.002），LPS作用30min NF-κB活性显著增加到1.89±0.04（P＜0.05）。LPS（30min）+阿托伐他汀（1μmol／L，12h）组NF-κB活性较LPS（30min）组显著降低（0.96±0.12 vs 1.89±0.04）（P＜0.05）。LPS（30min）+RNAi组NF-κB活性较LPS（30min）组显著降低（0.72±0.02 vs 1.89±0.04），且较LPS（30min）+阿托伐他汀（1μmol／L，12h）组显著降低（0.72±0.02 vs 0.96±0.12）（P＜0.05）。Western blot结果显示，与对照组相比，LPS作用30min胞浆IκB-α蛋白表达显著减少（P＜0.01）。IκB-α蛋白表达于LPS（30min）+阿托伐他汀（1μmol／L，12h）组较LPS（30min）组显著增加（P＜0.01）。然而LPS（30min）+RNAi组IκB-α蛋白表达较LPS（30min）组差异无统计学意义（P＞0.05）。4．TLR4小分子干扰RNA对LPS-TLR4通路诱导PI3K-Akt的作用Western blot结果显示，与LPS（30min）组相比，RNAi+LPS（30min）组p-Akt／Akt蛋白表达（0.73±0.07 vs 0.2±0.02），P65蛋白表达（43.4±1.29 vs 23.78±0.26）显著减少（P均＜0.05）与LPS（30min）组相比，Ly294002+LPS（30min）组胞浆P-Akt／Akt蛋白表达显著减少（0.73±0.07 vs 0.13±0.008），核蛋白p65蛋白表达显著减少（43.4±1.29 vs 12.16±0.33）（P均＜0.05），胞浆IκB-α蛋白表达差异无统计学意义（10.00±0.06 vs 9.89±0.19）（P＞0.05）。5．阿托伐他汀作用于ECV304细胞对LPS-TLR4通路诱导磷酸化MAPKs表达的影响Western blot结果显示，与对照组相比，LPS（30min）组P-ERK／ERK蛋白表达显著增加（0.018±0.0001 vs 0.786±0.0276）（P＜0.01）。LPS（30min）+阿托伐他汀（1μmol／L，12h）组较LPS（30min）组P-ERK／ERK蛋白表达显著减少（0.215±0.0060 vs 0.786±0.0276）（P＜0.05）。Western blot结果显示，与对照组相比，LPS（30min）组P-P38／P38蛋白表达显著增加（0.027±0.002 vs 0.782±0.015）（P＜0.05）。LPS（30min）+阿托伐他汀（1μmol／L，12h）组较LPS（30min）组P-P38／P38蛋白表达显著减少（0.690±0.008 vs 0.782±0.015）（P＜0.05）。Western blot结果显示，与对照组相比，LPS（30min）组p-JNK／JNK蛋白表达显著增加（0.053±0.004 vs 0.584±0.011）（P＜0.05）。LPS（30min）+阿托伐他汀（1μmol／L，12h）组较LPS（30min）组P-JNK／JNK蛋白表达差异无统计学意义（P＜0.05）。6．阿托伐他汀诱导LPS-TLR4-MAPKs信号对NF-κB转录活化的作用（1） ERK活性的抑制对NF-κB转录活化作用ELISA结果显示，LPS（30min）+PD98059+阿托伐他汀（1μmol／L，12h）组较LPS（30min）+阿托伐他汀（1μmol／L，12h）组NF-κB活性显著降低（0.75±0.049 vs 0.96±0.12）（P＜0.05）。Western blot结果显示，LPS（30min）+SN50+阿托伐他汀（1μmol／L，12h）组较阿托伐他汀（1μmol／L，12h）+LPS（30min）组P-ERK／ERK蛋白表达差异无统计学意义（0.221±0.0049 vs 0.215±0.0060）（P＜0.05）。（2） P38活性的抑制对NF-κB转录活化作用ELISA结果显示，LPS（30min）+SB203580+阿托伐他汀（1μmol／L，12h）组较LPS（30min）+阿托伐他汀（1μmol／L，12h）组NF-κB活性增加差异无统计学意义（1.08±0.21 vs 0.96±0.12）（P＞0.05）。Western blot结果显示，LPS（30min）+SN50+阿托伐他汀（1μmol／L，12h）组较LPS（30min）+阿托伐他汀（1μmol／L，12h）组P-P38／P38蛋白表达差异无统计学意义（0.695±0.0011 vs 0.690±0.0079）（P＞0.05）。（3）ERK与P38的相互作用Western blot结果显示，LPS（30min）+SB203580+阿托伐他汀（1μmol／L，12h）组较LPS（30min）+阿托伐他汀（1μmol／L，12h）组P-ERK／ERK蛋白表达显著增加（0.240±0.0051 vs 0.215±0.0060）（P＜0.05）。LPS（30min）+PD98059+阿托伐他汀（1μmol／L，12h）组较LPS（30min）+阿托伐他汀（1μmol／L，12h）组P-P38／P38蛋白表达差异无统计学意义（0.695±0.0023 vs 0.690±0.0079）（P＞0.05）。7．RNAi与阿托伐他汀对LPS-TLR4通路诱导效应蛋白表达的逆转作用ELISA结果显示，IL-6：LPS作用12h：LPS+阿托伐他汀组较LPS组IL-6蛋白表达差异无统计学意义。LPS+RNAi组较LPS组IL-6蛋白表达显著降低。LPS作用24h：LPS+阿托伐他汀组及LPS+RNAi组较LPS组IL-6蛋白表达显著降低。LPS+RNAi组较LPS+阿托伐他汀组IL-6蛋白表达显著降低。LPS作用48h：LPS+阿托伐他汀组较LPS组IL-6蛋白表达差异无统计学意义，LPS+RNAi组较LPS组IL-6蛋白表达显著降低。IL-10：LPS作用24h：LPS+阿托伐他汀组及LPS+RNAi组较LPS组IL-10蛋白表达显著增加。LPS+RNAi组较LPS+阿托伐他汀组IL-10蛋白表达显著增加。LPS作用48h：LPS+阿托伐他汀组及LPS+RNAi组较LPS组IL-10蛋白表达显著增加。LPS+RNAi组较LPS+阿托伐他汀组IL-10蛋白表达显著增加。TNF-α：LPS作用12h：LPS+阿托伐他汀组及LPS+RNAi组较LPS组TNF-α蛋白表达显著降低。LPS+RNAi组较LPS+阿托伐他汀组TNF-α蛋白表达显著降低。LPS作用24h：LPS+阿托伐他汀组及LPS+RNAi组较LPS组TNF-α蛋白表达显著降低。LPS+RNAi组较LPS+阿托伐他汀组TNF-α蛋白表达显著降低。LPS作用48h：LPS+阿托伐他汀组较LPS组TNF-α蛋白表达差异无统计学意义，LPS+RNAi组较LPS组TNF-α蛋白表达显著降低。8．腺病毒干扰载体的体外扩增、滴度测定及体外活性检测体外大量扩增pSuppressorAd-TLR4，pSuppressorAd-Neg腺病毒，空斑形成实验测定病毒滴度为6×10¹¹pfu／mL。荧光定量-PCR检测Ad-siRNA-TLR4组较对照组细胞RAW264.7抑制TLR4 mRNA表达达81％。Ad-siRNA-Neg组细胞无抑制作用。9．TLR4腺病毒干扰载体基因治疗与阿托伐他汀药物治疗ApoE-／-小鼠的实验研究：结果发现：（1）各组血TC、TG、HDL及LDL无明显变化，统计学无显著性差异（P＞0.05）（2）与安慰剂组比较，阿托伐他汀组ApoE-／-小鼠头臂干动脉斑块面积，斑块面积／血管面积减少但差异均无统计学意义（P＞0.05）。与安慰剂组比较，阿托伐他汀组ApoE-／-小鼠纤维帽增加，差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照载体组比较，RNAi组ApoE-／-小鼠斑块面积，斑块面积／血管面积减少但差异均无统计学意义（P＞0.05）。与对照载体组比较，RNAi组ApoE-／-小鼠纤维帽显著增加（4.53±0.32 vs 8.62±0.39μm）（P＜0.05）。与阿托伐他汀组比较，RNAi组ApoE-／-小鼠纤维帽显著增加（P＜0.05）。（3）油红O染色分析各组小鼠头臂干切片阳性染色区域面积均值：与安慰剂组比较，阿托伐他汀组ApoE-／-小鼠斑块脂质含量显著减少（P＜0.05）。与对照载体组比较，RNAi组ApoE-／-小鼠斑块面积脂质含量减少，差异无显著性（P＞0.05）。与阿托伐他汀组比较，RNAi组ApoE-／-小鼠斑块面积脂质含量显著增加（P＜0.05）。（4）斑块破裂率比较：各组斑块破裂率差异均无统计学意义。（5）易损指数比较：与安慰剂组比较，阿托伐他汀组ApoE-／-小鼠斑块易损指数显著减少，（1.72±0.09 vs 1.44±0.04）（P＜0.05）。与对照载体组比较，RNAi组ApoE-／-小鼠斑块易损指数显著减少，（1.75±0.06 vs 1.10±0.08）（P＜0.05）。与阿托伐他汀组比较，RNAi组ApoE-／-小鼠斑块面积易损指数显著减少（P＜0.05）。（6）免疫组织化学染色：与安慰剂组比较，阿托伐他汀组ApoE-／-小鼠斑块TLR4、MAMO-2抗原含量显著减少（P均＜0.05）。与对照载体组比较，RNAi组ApoE-／-小鼠斑块TLR4、MAMO-2抗原含量显著减少，SM-actin抗原含量显著增加（P均＜0.05）。与阿托伐他汀组比较，RNAi组ApoE-／-小鼠斑块面积TLR4、MAMO-2抗原含量显著减少，SM-actin抗原含量显著增加（P均＜0.05）。（7）荧光定量PCR检测：与安慰剂组比较，阿托伐他汀组ApoE-／-小鼠头臂干动脉TLR4、IL-6、IL-12和VCAM mRNA表达显著降低，IL-10 mRNA表达显著增加。与对照载体组比较，RNAi组ApoE-／-小鼠头臂干动脉TLR4、IL-6、IL-12、TNF-α、VCAM和MMP-9 mRNA表达显著降低，IL-10 mRNA表达显著增加。与阿托伐他汀组比较，RNAi组ApoE-／-小鼠头臂干动脉TLR4、IL-6、IL-12和TNF-αmRNA表达显著降低，IL-10 mRNA表达显著增加。结论1．实验室构建了TLR4基因RNA干扰载体pRNAT-TLR4-1，其可视的转染效率可确保试验的可靠性，且操作简单，适合长期研究基因功能。2．实验室建立了稳定抑制TLR4蛋白的细胞模型（ECV304-pTLR4-1细胞），可长期研究TLR4功能及其介导的信号通路。3．NF-κB是炎症免疫反应的枢纽，我们对比研究TLR4的小分子干扰RNA干预与阿托伐他汀干预对NF-κB的作用，发现RNAi较阿托伐他汀干预能更强的抑制NF-κB的活性，其机制可能为RNAi较阿托伐他汀干预能更有效的抑制LPS-TLR4通路且P38在阿托伐他汀干预抑制NF-κB活性中起负反馈作用。4．TLR4的小分子干扰RNA抑制NF-κB活性的作用不依赖IκB-α。其可能通过抑制PI3K／AKT而抑制p65活化，进而抑制NF-κB活性。5．阿托伐他汀通过稳定IκB-α抑制NF-κB活性。其机制可能为（1）通过稳定TAK1-IKKα依赖的IκBα活性而抑制NF-κB活性；（2）抑制ERK进而稳定IκBα，导致NF-κB转录活性降低。抑制P38活性可能对于ERK和NF-κB活性有负调控作用。6．阿托伐他汀能显著抑制IL-6、IL-10、TNF-α等炎性因子的释放，与之相比RNAi抑制炎性因子的释放时间更持久，效果更显著。7．ApoE-／-小鼠体内试验表明，TLR4小分子干扰腺病毒的基因治疗与阿托伐他汀的药物治疗均可降低斑块的易损性，但是基因治疗效果更优于药物治疗。8．ApoE-／-小鼠体内试验表明，TLR4小分子干扰腺病毒的基因治疗与阿托伐他汀的药物治疗抗AS作用机制可能与促炎／抗炎的平衡和胶原合成／降解的平衡、Th1／Th2免疫调控的平衡有关。