研究背景及目的：2012年数据显示肺癌患者在全球的死亡率接近五分之一。复发及转移仍是肺癌临床治疗失败的首要原因。越来越多的证据显示,微小RNA在人类肿瘤的发生发展中扮演着重要的角色。最近,miR-125b以及它的靶基因已经被证实在多种肿瘤的侵袭及迁移中扮演着重要的角色。例如,miR-125b能够直接调节C-Jun蛋白的表达或者同时在转录水平及翻译水平直接作用于丝氨酸／苏氨酸激酶混合谱系激酶(MLK]3来抑制黑色素瘤细胞的迁移。MiR-125b也被报道可以作为肿瘤抑制因子直接靶向PI3K/Akt/mTOR信号通路来抑制尤文氏肉瘤细胞的迁移和侵袭。MiR-125b在肝癌的转移中一方面能够通过抑制癌基因LIN28B的表达,也能够通过下调抑制因子SUV39H1起到抑制肿瘤的作用。除此之外,基质金属(MMP)13基因在皮肤鳞状细胞癌中作为miR-125b的直接靶基因,其表达被抑制。相反,在乳腺癌及I型子宫内膜癌细胞中,miR-125b已经被证实能够分别靶向抑癌基因(STARD)13和肿瘤蛋白TP53INP1扮演促癌基因的角色。肺癌病人,如果血清中miR-125b高表达,则明显预后较差。在我们课题组之前的研究中证实,在非小细胞肺癌细胞株中,下调miR-125b,能够逆转转移相关蛋白MTAl的侵袭和迁移。然而在非小细胞肺癌中miR-125b如何通过作用靶基因来阐明其在肿瘤细胞侵袭及迁移中的角色尚未明确。最近,我们通过生物信息学来预测它的靶基因。驱动蛋白轻链(KLC)2是基于生物信息学,从三个不同的公共的miRNA数据库(Targetscan, miRanda, miRWalk)所预测到的miR-125b的其中一个靶基因,我们预测到在KLC2的3’UTR区存在miR-125b的潜在的结合位点。KLC2是驱动蛋白-1中最具特征性的轻链同分异构体之一,在细胞中广泛表达,通过运输大量货物,包括细胞内的细胞器以及各种微管泡亚型,起到分子发动机的作用。Smad2在TGFβ信号传导过程中起着作用,Smad2还是一个已知的KLC2的结合伴侣,驱动蛋白-1的货物。TGFβ信号通路在致癌过程中发挥着多重作用。关于KLC2基因在肿瘤中的作用的另外一个线索来源于一个发现,KLC2参与被认为是前列腺癌易感基因以及参与与TGFβ诱导的Smad2信号通路的狐猴酪氨酸激酶-2的调节。在最近的研究中,我们评估了在非小细胞肺癌中KLC2的临床意义以及它在非小细胞肺癌恶性表型中的作用。下一步,我们证实在非小细胞肺癌中,KLC2为miR-125b的靶基因,并且认定它们之间能够直接作用。实验材料及方法：1、组织样本和组织芯片16例新鲜非小细胞肺癌组织(萨8)及其临近癌旁组织(n=8)从南方医科大学南方医院心胸外科手术室获得。所有的病人术前均未接受过放疗或化疗。癌旁组织及肿瘤组织均通过南方医院病理科证实。140对人类非小细胞肺癌及其临近癌旁组织芯片购于上海芯超生物科技有限公司。2、细胞培养人类非小细胞肺癌细胞株(SPC-A-1,95D, A549, H460和H1299)购于中国科学院上海细胞库,用RPMI-DMEM (Hyclone)加10%胎牛血清(FBS, Gibco, USA)组成的完全培养基培养。所有的细胞均在37℃含5%CO2的湿润的孵箱中培养。3、质粒及寡核苷酸的构建KLC2(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM 022822的编码序列克隆进pReceive-M98载体(由GeneCopoeia,USA合成),其编码序列并不包含与miR-125b在3’UTR区的结合位点。靶向人类KLC2基因的短小RNA序列被克隆进hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin载体,形成KLC2-si质粒,质粒转染时以scramble siRNA也就是KLC2-si/control作为对照。4、瞬时转染转染之前18-24h,先将实验用的细胞株接种子6孔板中(2×105/孔)。适量的质粒(3ug/孔),miR-125b inhibitor,mimics或NC (100 pmol)加入相应的孔中,使用Lipofectamine 3000(Invitrogen)进行转染。转染之后在37℃含5%CO2的湿润的孵箱中孵育,转染48 h后收细胞。KLC2和miR-125b在SPC-A-1及95D细胞株中的共转染也遵循相似的操作步骤。5、RNA的提取和反转录实时荧光定量PCR人类非小细胞肺癌细胞株及新鲜组织标本的总RNA使用Trizol reagent (Takara,大连,中国)来提取,所有步骤均参照说明书。总RNA提取后按照试剂盒中的说明书步骤(PrimeScript RT reagent Kit, TaKaRa, Dalian, China)来逆转录合成cDNA以及PCR反应。各引物序列均由英潍捷基公司合成。最后采用2-ΔΔCt法来计算miR-125b和KLC2的相对表达率。6、蛋白免疫印迹使用RIPA裂解液提取组织标本以及细胞中的总蛋白。在下面各章节中我们会详细阐述步骤。Anti-p-actin抗体作为内参使用。最后,蛋白免疫印记条带使用软件QuantityOne v4.6.2来显像。7、划痕实验将经胰酶消化好的细胞分别接种1×106/孔于6孔板,完全培养基培养过夜,相应的质粒或寡核苷酸转染处理细胞,待细胞长至约90%汇合时,用10u1枪头垂直在培养孔中部轻轻划过,继续培养48h。每个孔随机选取5个有划痕穿过的视野,分别观察0h,48h时各组细胞划痕处细胞的运动变化,并拍照取样,应用ImageJ软件测划痕相对宽度,独立实验重复3次。8、Transwell、室细胞迁移和侵袭实验本实验所用Transwell小室购自BD Bioscience(Bedford, MA, USA,24-well insert,孔径： 8 μm)。细胞转染之后取对数期的生长细胞,胰酶消化后轻轻吹打均匀,终止消化后离心弃去培养液,PBS洗1-2遍,用含BSA的无血清培养基重悬,调整细胞密度至1-10x105,取4×105/200-1细胞悬液于上室,然后加500μl含10%胎牛血清的完全培养基于下室,370C培养24～48h。取出小室,固定染色,室温空气风干。显微镜下随机选取5个高倍视野计数穿过膜的细胞数。每次实验重复3次。细胞侵袭实验是在Transwell小室底部膜铺上人工重构基底膜材料Matrigel,方法步骤同细胞迁移实验。9、双荧光素酶实验报告系统双荧光素酶实验报告系统质粒基因由上海吉玛基因合成,报告系统质粒基因片段包括KLC2 3’UTR生型或突变型。在荧光素酶报告实验中,所用细胞株为293T和SPC-A-1细胞株,转染试剂为购于广州英潍捷基公司的Lipofectamine3000,整个步骤遵循共转染的步骤。共转染后48小时收取细胞,荧光素酶的活性由双荧光素酶实验报告系统测定(Promega, Madison,WI, USA),最后以海肾荧光值作为内参计算出萤火虫荧光以及海肾荧光的活性比率。10、免疫组化免疫组化试剂盒购于北京中杉金桥。KLC2抗兔多克隆抗体(1:100; Proteintech,USA;17668-1-AP)为实验用一抗。最终免疫组化染色评分采用半定量的方法。整个免疫组化实验参照中杉金桥的免疫组化试剂盒说明书进行。免疫组化双重染色试剂盒(Mo/HRP+Rb/AP)也购于中杉金桥(货号：DS-0001),实验步骤均按照试剂盒说明书进行。11、统计学分析采用SPSS13.0软件进行统计分析,所有实验均至少重复3次,实验中所有的数据均采用均数±标准差表示。两样本均数的比较采用两独立样本的t检验(two-tailed unpaired Student’s t-test) (qRT-PCR,划痕实验,迁移或侵袭实验,双荧光素酶实验),p<0.05认为有统计学意义。两组以上样本均数比较采用完全随机设计资料的方差分析(One-Way ANOVA),方差齐性检验采用Levene’s Test。 MiR-125b和KLC2的相关性分析采用Spearman’s相关。Kaplan-Meier方法和the log-rank检验来评估KLC2高表达肺癌患者总的生存预后。KLC2表达水平与各临床病理参数之间的关系采用χ2检验。Cox比例风险模型的单因素以及多因素分析来决定Hazard ratio (HR)以及预后因子。实验结果：1、KLC2蛋白在NSCLC细胞株中高表达,在老年NSCLC患者中为独立的不良预后因素。蛋白免疫印迹结果显示,跟正常肺上皮细胞HBE相比,在非小细胞肺癌细胞株中KLC2蛋白是高表达的,而且,在A549,H460以及H1299细胞中的表达高于在SPC-A-1和95D中的表达。观察细胞的迁移及侵袭能力发现,KLC2蛋白高表达的NSCLC细胞株的迁移和侵袭能力也较强。免疫组化观察组织芯片中KLC2蛋白表达时发现,在肿瘤细胞中KLC2蛋白高表达,且高表达主要集中在细胞浆中,在正常肺组织细胞呈低表达或不表达。免疫组化双重染色发现,KLC2蛋白主要在肿瘤细胞细胞浆中表达,染色呈现红色,而Ki-67主要在细胞核中表达,染色呈现棕色。在140例人类原发非小细胞肺癌组织中,67.1%的标本中KLC2呈高表达,而在140例临近癌旁组织中,只有2.1%呈高表达,二者比较具有统计学显著性。在140例NSCLC患者中,KLC2的表达水平与各临床病理特征未见明显相关性。但在老年NSCLC患者中(≥60岁,81例),KLC2高表达影响患者总生存率,p=0.026,具有统计学显著性。多因素分析显示,KLC2高表达在老年NSCLC患者中是独立的不良预后因素。在男性、鳞癌、NO期或者临床分期Ⅰ/Ⅱ期的病人中,KLC2蛋白高表达也预示着患者有预后不良的趋势。2、KLC2明显增强了NSCLC细胞株的侵袭迁移能力。利用瞬时转染,成功构建KLC2敲除及过表达细胞株。在MTT实验中发现,在：NSCLC细胞株中,KLC2过表达或敲除对细胞的增殖能力没有影响。SPC-A-1、95D细胞株中,划痕实验、transwell:迁移及侵袭实验均表明KLC2过表达明显增强了细胞株的迁移及侵袭能力,差异具有统计学显著性。相反,KLC2的下调则明显降低了细胞株的迁移和侵袭能力。3、miR-125b通过靶向KLC2 3’UTR区抑制KLC2蛋白的表达。生物信息学预示在KLC2的3’UTR区存在miR-125b的结合位点。为了证明miR-125b能直接作用于KLC2的3’UTR区,从而靶向KLC2的表达,我们设计了双荧光素酶报告系统,克隆了KLC2 3’UTR区野生型及突变型荧光素酶报告基因。将野生型或突变型荧光素酶报告基因与miR-125b mimics或者miR-control共转染进]HEK-293T和SPC-A-1细胞株中,我们发现跟对照相比,miR-125b过表达使野生型KLC2 3’UTR区荧光素酶的活性减少了2倍,而在突变型的KLC2 3’UTR区荧光素酶活性未见明显变化。RT-PCR检测在人类5株NSCLC细胞株中miR-125b的表达水平,结果显示,KLC2高表达的细胞株(A549,H460和H1299)与KLC2低表达的细胞株(SPC-A-1和95D)相比,miR-125b的表达水平明显受抑制。为了进一步证实miR-125b能直接作用于KLC2,我们利用RT-PCR夏蛋白免疫印记分别检测在miR-125b敲除及过表达后,KLC2 mRNA以及蛋白水平的变化。数据显示,在SPC-A-1和95D细胞株中,miR-125b上调后,KLC2蛋白表达水平下调了1-2.4倍,相反,miR-125b下调后,KLC2蛋白表达升高。在mRNAA平上,miR-125b过表达或敲除对KLC2 mRNA表达的影响不足40%。在8对人类新鲜NSCLC组织及其癌旁组织样本中,KLC2蛋白表达与miR-125b的表达呈现明显的负相关(R-0.691,p=0.003)。4、KLC2影响miR-125b对NSCLC细胞株侵袭迁移能力的抑制作用。为了进一步证实KLC2作为关键因子能影响miR-125b对NSCLC细胞株迁移及侵袭能力的抑制作用,在SPC-A-1和95D细胞株中,我们将KLC2和miR-125b共同过表达。qRT-PCR和western blotting检测转染效率。miR-125b上调后对KLC2在]mRNA水平及蛋白水平的影响与之前实验结果一致。KLC2过表达后并未对miR-125b的表达产生影响。另一方面,miR-125b能明显降低NSCLC细胞株的迁移及侵袭能力,这与KLC2在NSCLC中的作用正好相反。更重要的是,在SPC-A-1和95D细胞株中,外源性的KLC2几乎完全拮抗了miR-125b对细胞株侵袭迁移能力的抑制作用。实验结论：1、KLC2蛋白在NSCLC细胞株及组织中高表达,在老年NSCLC患者中,KLC2蛋白高表达是独立的不良预后因素。2、KLC2明显增强了NSCLC细胞株的侵袭及迁移能力。3、MiR-125b通过靶向KLC2 3’UTR区抑制KLC2蛋白的表达。在NSCLCI临床组织样本中,miR-125b表达与KLC2蛋白表达呈负相关。4、KLC2几乎完全拮抗了miR-125b对NSCLC细胞株侵袭迁移能力的抑制作用。5、KLC2作为miR-125b的功能性靶基因,扮演着原癌基因的角色。