中药成分复方GC方通过调节线粒体稳态治疗非酒精性脂肪肝机制研究

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目的:  基于前期有关中药成分复方GC方(京尼平苷和绿原酸以固定比例组成)有效防治非酒精性脂肪病(NAFLD)病理进程的工作基础,本课题着重研究该方促进线粒体能量代谢和降低肝细胞氧化应激损伤的关键药理环节和分子学机制,深入阐释GC方改善线粒体功能的优势和配伍特点。为进一步研发治疗NAFLD显效、机制明确的新型中药制剂提供科学坚实的理论依据。  方法:  1.GC方改善线粒体能量代谢障碍和氧化应激损伤的药效学观察  1.1、根据脂肪酸介导的NAFLD“二次打击”学说,模拟构建棕榈酸诱导线粒体脂毒性损伤细胞模型,观察GC方及其京尼平苷和绿原酸单一成分对脂毒性肝细胞活性、线粒体功能和结构损伤的保护作用。  1.2、运用高脂饮食诱导的NAFLD大鼠模型,观察和比较GC方及其单一成分组对NAFLD大鼠肝组织甘油三酯(TG)蓄积、肝细胞炎症、线粒体呼吸链功能障碍和氧化应激损伤的改善作用。  1.3、运用CCL4诱导小鼠肝脏急性脂质过氧化损伤模型,观察和比较GC方及其单一成分组对化学毒性小鼠肝细胞炎症、线粒体能量代谢障碍和脂质过氧化损伤的保护作用。  2.GC方调节肝细胞线粒体稳态治疗NAFLD的机制研究  2.1、分别提取NAFLD大鼠模型实验和CCL4小鼠肝急性肝损伤模型实验肝组织总蛋白和线粒体蛋白,检测观察线粒体SIRT3和线粒体乙酰化蛋白的表达水平,SIRT3调控下游与线粒体脂肪酸分解(CPT2)、能量代谢(NDUFA9)和清除氧自由基(MnSOD)相关的调节蛋白乙酰化水平。  2.2、分别建立线粒体导向野生型和失活突变型CDK1稳转肝细胞株、野生型和CDK1磷酸化位点失活突变型SIRT3稳转肝细胞株,提取细胞和动物肝组织线粒体蛋白检测CDK1-T161和SIRT3蛋白的表达,CDK1和SIRT3结合程度以及SIRT3磷酸化水平。观察GC方通过线粒体CDK1-SIRT3通路对肝细胞线粒体脂毒性损伤的保护调节机制。  结果:  1.GC方改善脂毒性和化学毒性线粒体能量代谢障碍和氧化应激损伤  1.1、与棕榈酸诱导的线粒体脂毒性损伤细胞相比,GC方可显著降低肝细胞内脂滴的沉积和TG含量,提高细胞活性和线粒体膜电位水平,保护肝细胞线粒体膜通透性(MMP)、ATP合成、呼吸链耗氧量(OCR)和MnSOD活性,降低线粒体内O2-蓄积,改善棕榈酸诱导线粒体超微结构的破坏,提高AML12细胞线粒体质量分数。GC方对棕榈酸诱导线粒体结构和功能损伤的保护作用优于各单一成分。  1.2、与高脂饮食诱导的NAFLD大鼠模型相比,GC方可显著降低NAFLD大鼠体重、肝湿重、肝组织内TG含量,改善肝组织脂肪变性和炎症浸润程度,降低大鼠血清ALT、AST和m-AST酶活性水平,调节升高肝实质细胞MMP、ATP合成和MnSOD活性,降低肝实质细胞线粒体O2-蓄积。同时,复方对高脂饮食诱导大鼠肝脏脂肪酸的沉积、肝细胞炎症、线粒体能量代谢障碍和氧化应激损伤的保护作用优于各单一成分干预组。  1.3、与CCL4诱导小鼠肝脏急性脂质过氧化损伤模型组相比,GC方可有效改善肝组织炎症浸润程度,降低小鼠血清ALT、AST和m-AST酶活性水平,升高肝实质细胞线粒体膜电位、ATP合成和MnSOD活性,降低线粒体内O2-蓄积,维护线粒体的双层膜结构的完整性。GC方改善CCL4诱导小鼠肝组织脂质过氧化的保护作用优于各单一成分。  2.GC方通过调节CDK1-SIRT3通路保护肝细胞线粒体损伤机制  2.1、 GC方显著降低NAFLD大鼠和脂毒性小鼠肝组织线粒体乙酰化蛋白的表达,提高SIRT3下游与线粒体脂肪酸分解(CPT2)、能量代谢(NDUFA9)和清除氧自由基(MnSOD)相关的调节蛋白的去乙酰化程度。但GC方并不影响肝组织SIRT3蛋白的表达。  2.2、与线粒体导向野生型CDK1细胞株相比,棕榈酸可明显抑制线粒体导向突变失活型CDK1细胞株和Thr150/Ser159位点失活突变型SIRT3肝细胞株的细胞活性、线粒体呼吸链功能,增加线粒体内氧化应激产物,降低线粒体对活性氧的清除能力。  2.3、 GC方可显著提高线粒体CDK1-T161蛋白的表达和SIRT3磷酸化水平。与正常肝细胞相比,GC方对脂肪酸诱导线粒体导向突变失活型CDK1细胞株细胞活性、线粒体能量代谢障碍和氧化应激损伤的保护作用明显减弱甚至消失。  结论:  1.GC方可有效改善实验NAFLD模型和化学毒性模型肝细胞线粒体能量代谢障碍和氧化应激损伤。其促进线粒体能量代谢和抗氧化应激损伤保护作用与抗氧化剂—维生素E效果相当并优于各单一成分组。  2.线粒体CDK1-SIRT3及下游线粒体代谢调节网络是GC方有效调节线粒体稳态治疗NAFLD的重要途径。  3.中药成分复方GC方对不同致病因素诱导的线粒体损伤具有配伍增效和解毒的作用。
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