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肿瘤多药耐药(multidrug resistance,MDR)现象是导致化疗失败的主要原因。国内外已在细胞膜、细胞质和细胞核中发现了多种MDR相关分子并推测相应的分子机制,但是并不能完全解释肿瘤的MDR现象。肿瘤细胞与细胞外基质的粘附可以导致耐药,并将这种形式的耐药称为细胞粘附介导的耐药(cell adhesion mediated drug resistance,CAM-DR)。研究发现,人67kDa层粘连蛋白受体(human 67kDa laminin receptor,67LR)介导的结肠癌细胞与细胞外基质成分层粘连蛋白(laminin,LN)的粘附与肿瘤的多种生物学行为密切相关。本研究旨在研究67LR介导结肠癌细胞与细胞外基质成分LN粘附对于其药物敏感性的影响,并深入探讨67LR作为粘附分子参与结肠癌CAM-DR的分子机制,将有助于全面理解结肠癌MDR的发生和调节机制。目的:研究粘附状态下结肠癌细胞SW480对于多种化疗药物的耐受性,并初步探讨其耐药机制;以67LR表达下调的结肠癌细胞亚系为模型,在67LR与其特异性配体LN相互识别介导SW480细胞粘附的状态下,深入探讨67LR的功能及其介导结肠癌细胞CAM-DR的分子机制,将有助于全面理解结肠癌MDR的发生和调节机制。方法:第一部分:1.通过细胞粘附实验研究结肠癌细胞SW480与细胞外基质重要组分LN及阴性对照成分牛血清白蛋白(BSA)粘附能力的差别;2.通过MTT比色法检测粘附于LN以及BSA的结肠癌细胞SW480对于化疗药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)和顺铂(DDP)的药物敏感性;3.借助流式细胞仪(FCM)检测粘附于LN以及BSA的SW480细胞内阿霉素的蓄积和潴留,并计算相应的药物泵出率;4.通过Annexin V/PI染色法检测粘附于LN以及BSA的结肠癌细胞SW480在化疗药物诱导下的凋亡,并计算相应凋亡指数。第二部分:构建67LR的siRNA载体并转染SW480细胞,筛选并建立67LR表达下调的SW480转染细胞亚系。第三部分:1.通过细胞粘附实验检测结肠癌细胞稳定转染亚系SW480-si67LR及其对照细胞与LN以及BSA的粘附能力的差别;2.通过MTT比色法检测粘附于LN以及BSA的结肠癌细胞稳定转染亚系SW480-si67LR及其对照细胞对于化疗药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)和顺铂(DDP)的药物敏感性;3.通过Annexin V/PI染色法检测粘附于LN以及BSA的结肠癌细胞稳定转染亚系SW480-si67LR及其对照细胞在化疗药物诱导下的凋亡,并计算相应凋亡指数;4.通过Western Blot检测粘附于LN以及BSA的结肠癌细胞稳定转染亚系SW480-si67LR及其对照细胞中凋亡信号途径相关蛋白FAK的总蛋白及磷酸化蛋白、Bcl-2和Bax的表达。结果:第一部分:1.在单位时间内,LN组中结肠癌细胞SW480的粘附细胞数均明显高于BSA组(p<0.05);2.与粘附于BSA的结肠癌细胞SW480相比,粘附于LN的SW480细胞的化疗药物敏感性显著下降,对于化疗药物的IC50均相应显著升高,化疗药物诱导的凋亡指数明显减少;细胞内阿霉素的蓄积和潴留均明显减少,药物泵出率显著增加(p<0.05)。第二部分:成功筛选并建立67LR表达下调的SW480转染细胞亚系。第三部分:1.在单位时间内,LN组和BSA组内67LR表达水平下调的结肠癌转染细胞SW480-si67LR的粘附细胞数均明显低于其对照细胞(p<0.05);2.与LN粘附后,在结肠癌转染细胞SW480-si67LR及其对照细胞中均检测到磷酸化FAK的不同程度的表达,其中SW480-si67LR中磷酸化FAK的表达水平表达明显下调,其相对表达率具有显著的统计学差异(p<0.05);3.与对照成分BSA粘附后,在结肠癌转染细胞SW480-si67LR及其对照细胞中均检测不到磷酸化FAK的不同程度的表达;4.与LN及其对照成分BSA粘附后,SW480-si67LR及其对照细胞中总FAK的表达无统计学差异(p<0.05);5.在与LN粘附条件下,与其对照细胞相比67LR表达水平下调的结肠癌转染细胞SW480-si67LR的化疗药物敏感性显著上升,对于化疗药物的IC50相应显著下降,化疗药物诱导的凋亡指数明显增加;细胞内Bcl-2的表达显著降低,Bax表达显著增强(p<0.05)。结论:1.与细胞外基质成分LN粘附后,结肠癌细胞可能通过以下两种途径增强自身的多药耐药性:i.提高肿瘤细胞对药物转运的能力,导致化疗药物在肿瘤细胞内蓄积的减少;ii.提高抗凋亡的能力,导致逃避对化疗药物诱导的凋亡;2. 67LR与结肠癌细胞的粘附能力密切相关,下调67LR的表达水平,结肠癌细胞的粘附能力显著减弱;3.当结肠癌细胞SW480膜表面的67LR与其特异性配体LN(细胞外基质成分)相互识别而介导细胞粘附后,可能通过诱导细胞内FAK的磷酸化而激活凋亡相关通路,从而能够上调Bcl-2及下调Bax的表达水平,从而抑制了化疗药物诱导的粘附状态下结肠癌细胞的凋亡。