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第一部分 改良Allen’s法建立大鼠损伤挫伤型脊髓中度损伤模型目的:采用改良Allen’s法建立大鼠挫伤型脊髓中度损伤模型,观察脊髓损伤组、假手术组在脊髓损伤后后肢功能评分(BBB评分)及组织学区别。方法:使用脊髓打击器建立大鼠胸9挫伤型脊髓中度损伤模型,对脊髓损伤后后肢运动功能变化采用BBB评分法评价,βⅢ-tubulin免疫荧光染色对两组脊髓损伤后的组织学变化进行观察。结果:大鼠胸9脊髓挫伤后,假手术组的神经元结构基本完整,形状正常,分布匀称,细胞间质匀称,神经元排列较整齐;而SCI组可见神经元结构欠完整,神经突出基本消失,细胞间质模糊混乱。脊髓损伤组与假手术组的BBB评分差异有统计学意义(p<0.05)。结论:1.成功建立大鼠挫伤型脊髓中度损伤模型;2.BBB评分脊髓损伤组明显低于假手术组。第二部分 大鼠脊髓损伤后miR-21及其凋亡因子PDCD4、PTEN的表达目的:阐明大鼠脊髓损伤后miR-21的基因表达变化及凋亡因子PDCD4、PTEN的表达、时间分布和其在脊髓损伤中的作用。方法:60只成年大鼠,SPF级,体重为200-250g,损伤组采取改良Allen’s法建立大鼠T9挫伤型脊髓损伤模型,假手术组只做椎板切除术,各组造模后4h、8h、1d、3d、7d取材,运用Real-time PCR检测脊髓损伤前后miR-21的表达变化;同时采用Western-blot检测miR-21相关靶基因PDCD4和PTEN的表达,观察miR-21是否通过调控其靶基因PDCD4和PTEN的表达影响脊髓损伤的修复。结果:与假手术组相比,miR-21的表达水平在SCI后4小时、8小时和1天均低于正常组织,各组与假手术组相比均存在统计学差异(P<0.05);而损伤后3天和7天miR-21的水平则显著高于假手术组(P<0.05),呈现先降低再升高的变化趋势。PDCD4在损伤后1天表达增加,3天其蛋白表达水平达到高峰,损伤后7天表达水平有所下降。与假手术组相比,损伤后1天和3天PDCD4的表达量与损伤前比较具有统计学差异(P<0.01)。p-PTEN的表达在脊髓损伤后1天最高,损伤后3天表达量有所下降,损伤后7天基本降至损伤前水平;脊髓损伤后1天(P<0.01)和3天(P<0.05)的表达水平与假手术组相比存在统计学差异。p-PTEN在SCI后7天回落至脊髓损伤前的表达水平。结论:在SCI的一周时间内,miR-21表达增高PDCD4和PTEN的表达水平则下降,表明了 miR-21在继发性损伤阶段抑制了凋亡因子PDCD4和PTEN的表达,在促进损伤后修复和抑制胶质疤痕的形成中发挥了重要作用。PDCD4和PTEN的表达与miR-21在脊髓损伤后表达的相关性,表明miR-21能够通过调控凋亡因子抑制胶质疤痕、促进损伤后修复。第三部分 重组腺相关病毒载体介导miR-21过表达通过抑制凋亡蛋白PDCD4促进轴突再生目的采取改良Allen’s法建立大鼠挫伤型脊髓损伤模型,研究重组腺相关病毒载体RAAV-miRNA-21对靶蛋白PDCD4的调节作用以及对神经元轴突生长的影响。方法分离并培养胎鼠脊髓原代神经元。通过hU6-MCS-CMV-EGFP rAAV载体,分别将 rAAV-pri-miRNA-21、rAAV-in-miRNA-21、rAAV-nc-miRNA 感染胎鼠脊髓神经元,通过β-Ⅲ tubulin标记的免疫荧光检测各组神经元轴突生长情况,Western blot检测PDCD4表达。结果在用rAAV-in-miRNA-21转导的神经元培养中,神经元要么延长很短的神经突,要么完全不延长。相比之下,过表达miRNA-21的神经元与正常对照组或nc-miRNA组相比,神经突生长明显增加(图7)。量化所有神经元轴突平均长度结果表明,miRNA-21显著增加所有神经元轴突的平均长度(415±16.7mm),而对照组(198±11.2mm)和 nc-miRNA 组(185±10.6mm)(p<0.05)。量化最长神经元轴突的平均长度结果表明,miRNA-21显著增加平均长度最长的神经元轴突(234±7.1mm),而对照组(121±3.9 毫米)和 nc-miRNA 组(109±4.7 毫米),分别(p<0.04)。Western blot分析显示,与对照组相比,PDCD4表达下降35%(p<0.05),PTEN蛋白水平无明显变化。结论过表达miR-21通过调节靶蛋白PDCD4的表达,增加神经突的伸展,促进出生后大鼠脊髓神经元的神经突生长。