论文部分内容阅读
朊病毒病（prion disease）,又称可传播性海绵状脑病（Transmissible spongiform encephalopathies,TSE）,是一类侵袭人和动物神经系统的退行性疾病,具有极长的潜伏期和100%的致死率。近年来,在全球范围内无论在人群中还是在动物群中,朊病毒病的发病率均呈上升趋势,同时因其具有极长潜伏期、高传染性和100%致死性而对公共卫生安全造成了极大的潜在危害。朊病毒病的感染因子是朊病毒,该病毒是一种不含核酸、可自我复制和感染性的蛋白质（Pr PSc）。可使对蛋白酶敏感的正常朊蛋白（Pr PC）转变为结构异常的、对蛋白酶抵抗的痒病样朊蛋白（Pr PSc）。大量的Pr PSc在中枢神经系统沉积导致神经细胞死亡丢失、反应性胶质细胞增生和海绵空泡样变性,这也是朊病毒病的典型病理改变。钙调蛋白（CaM）是一种普遍存在的钙结合蛋白,可最多结合四个钙离子,并作为钙信号的主要转导物。Ca2+的结合诱导CaM中的构象变化,即暴露其疏水残基,其促进Ca2+/CaM复合物与许多靶向蛋白的相互作用,并随后调节它们的功能。CaM及其下游底物的异常改变已经在一些神经退行性疾病中报道,但在朊病毒病中却鲜有描述。在本研究中,利用Western blot、组织免疫化学、组织免疫荧光等方法检测了CaM及其相关蛋白在羊瘙痒因子139A感染小鼠、263K感染仓鼠脑组织和朊病毒感染的细胞系SMB-S15中的潜在变化。通过Western blot方法发现,在139A感染小鼠脑组织中CaM水平异常升高,下游激酶CaMKII、磷酸化的CaMKII（p-CaMKII）及p-CaMKIV表达水平增加。CaMKs的下游调控蛋白c AMP调控元件结合蛋白（c AMP response element binding protein,CREB）及其磷酸化形式（p-CREB）均呈上调趋势,而其下游调控蛋白脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF）表达则明显下调,通过免疫组织化学实验发现,CaM主要分布于139A感染小鼠的皮层、丘脑和小脑区域。在对羊瘙痒因子263K感染的仓鼠脑组织的研究中发现,CaM表达水平在朊病毒感染早期开始增加并且一直维持在较高水平直到终末期。免疫组织化学测定显示增加的CaM主要累积在263K感染仓鼠的皮质、丘脑和小脑区域。免疫荧光实验结果显示了CaM与Neu N阳性细胞存在共定位。然而,相关激酶,如CaMKII、CaMKIV及其磷酸化形式,以及下游蛋白如CREB和BDNF在263K感染仓鼠脑组织中减少。进一步研究显示在263K感染仓鼠的脑组织中CaM的S-亚硝基化（SNO）形式明显增加。在朊病毒感染细胞系中,SMB-S15细胞的CaM水平较之对照细胞SMB-PS明显增加,同时下游蛋白如CaMKII、p-CaMKII、CREB以及BDNF也增加,尤其体现在细胞核中。而在朊病毒感染的SMB-S15细胞系中,并未检测到SNO-CaM。综上所述,我们的体内及体外实验结果显示CaM在朊病毒感染中异常增加。在培养的细胞以及羊瘙痒因子139A感染的仓鼠脑组织中,增加的CaM可以触发其下游激酶的激活。但在羊瘙痒因子263K感染的仓鼠的脑组织中,增加的CaM似乎不再激活其下游激酶,可能是由于在朊病毒感染期间其增加的CaM主要来自SNO-CaM,从而影响了其自身的活性。