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目的:构建S期激酶相关蛋白2(Skp2)特异性RNA干扰慢病毒表达载体,抑制子宫内膜癌HEC-1-A细胞中Skp2基因的表达。研究Skp2基因沉默后P27、CyclinD1、Caspase-3表达的变化,以及对HEC-1-A细胞周期、凋亡和增殖的影响。方法:构建U6启动子驱动、带有绿色荧光蛋白(GFP)标志的、表达针对Skp2基因的慢病毒LV-shRNA载体,转染HEC-1-A细胞,同时以转染阴性载体的HEC-1-A细胞作为对照。荧光显微镜观察GFP表达以确定转染效率,采用RT-PCR、荧光实时定量PCR在mRNA水平检测Skp2基因表达的变化,采用Western blotting在蛋白质水平检测Skp2基因表达的变化,以明确RNAi的抑制效率。并运用同样的方法分别从mRNA和/或蛋白质水平检测P27、CyclinD1、Caspase-3表达的变化,通过细胞计数、CCK-8法、流式细胞技术检测Skp2 RNA干扰后细胞增殖、凋亡和细胞周期的变化,分析Skp2基因沉默对P27、CyclinD1、Caspase-3表达水平以及细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。结果:1.成功构建了四对针对Skp2基因不同位点的RNAi慢病毒表达载体,经PCR和测序鉴定干扰片断的碱基序列及插入位点完全正确;2.在293T细胞中包装慢病毒,获得高滴度慢病毒上清;3.利用重组慢病毒载体将Skp2 shRNA转导入子宫内膜癌HEC-1-A细胞中,其转染效率可达到70%以上;4.构建的重组慢病毒LV-Skp2-1、LV-Skp2-2、LV-Skp2-3、LV-Skp2-4无论在mRNA水平还是在蛋白质水平均能抑制Skp2基因的表达,其中LV-Skp2-3、LV-Skp2-4的基因沉默效果较好,抑制率可以达到50%以上;5.利用RNAi技术沉默Skp2基因表达,对p27、cyclinD1的mRNA表达水平没有影响,却可以在蛋白质水平上调P27的表达,并下调CyclinD1的表达;6.抑制Skp2基因表达影响HEC-1-A细胞周期的进程,使其发生G2/M期阻滞;7.下调Skp2基因表达抑制了HEC-1-A细胞增殖,使其生长速度减缓。8.抑制Skp2基因表达对HEC-1-A细胞凋亡没有显著影响。结论:利用RNA干扰技术,可有效下调Skp2基因的表达,引起P27蛋白表达的上调和CyclinD1蛋白表达的下调,但对p27、cyclinD1的mRNA表达水平没有影响。Skp2基因的沉默影响HEC-1-A的细胞周期,发生G2/M期阻滞,进而抑制了细胞的增殖,使细胞的生长速度减慢,然而对细胞凋亡却没有太大的影响。Skp2有望成为子宫内膜癌辅助基因治疗的潜在靶点。