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目的: 观察大鼠脑出血后血肿周围脑组织中ROCKⅡ的表达规律及其在脑出血后脑损伤中的作用,ROCK特异性抑制剂Y-27632对大鼠脑出血后神经功能、脑水肿、血脑屏障和细胞凋亡的影响,RhoA抑制剂胞外酶C3(exoenzyme C3)及凝血酶抑制剂阿加曲班对ROCKⅡ表达的影响。
方法: 取雄性SD大鼠,采自体血(50μl)注入右侧尾状核制作脑出血模型,于注射后各时间点(0.5h、6h、12h、24h、48h、72h、5d)处死大鼠并取右侧尾状核,采用Western blot方法检测出血侧ROCKⅡ含量的动态变化。再取雄性SD大鼠,随机分为假手术组(作为对照组,同侧尾状核内注射生理盐水,S组),脑出血组(ICH组),exoenzyme C3组(C3组),Y-27632组,阿加曲班组(Arg组)。采自体血(50μl)注入右侧尾状核制作脑出血模型,C3、Y-27632、Arg组分别在出血后3h时经针道将exoenzyme C3(2μg/mL)、Y-27632( 2.5μg/mL )、阿加曲班(0.5μg/mL)原位注射入血肿中。于注射后各时间点(0.5h,6h,12h,24h,48h,72h,5d)处死大鼠并取右侧尾状核,采用免疫组化方法检测出血侧ROCKⅡ的含量变化及分布。在出血后24h(ROCKⅡ表达高峰时间点)时采用干湿重法测脑组织含水量,TUNEL原位标记法检测血肿周围凋亡细胞数量,伊文思蓝(EB)测血脑屏障(BBB)通透性,出血48h时HE染色法观察炎性细胞浸润将以上结果进行统计学分析。
结果: 在造模后0.5 h,各组病灶周围即可见ROCKⅡ阳性细胞表达,ICH组、Arg组、C3组24 h达高峰,以后逐渐下降,但在12h后(包括12h)相应时间点Arg组、C3组的ROCKⅡ表达水平明显低于ICH组(P<0.01)。假手术组病灶周围ROCK的表达水平均明显低于脑出血组,且细胞着色浅,不同时间点并且没有变化趋势。脑出血组western-blotting蛋白条带所显示ROCKⅡ蛋白表达趋势和免疫组化结果一致。ICH组、Arg组、C3组、Y-27632组出血侧脑组织含水量分别为83.63±0.55%、79.46±1.27%、80.10±1.07%、78.08±0.83%,Arg组、C3组、Y-27632组和ICH组比较差异有统计学意义;同Arg组、C3组、Y-27632组比较,ICH组血肿周围组织中可见到更多TUNEL阳性细胞(P<0.01,C3组 P<0.05)及炎症细胞,且脑组织EB含量高于Arg组、C3组、Y-27632组(P<0.01),差异有统计学意义。
结论:
1.ROCK蛋白参与脑出血后脑损伤的病理生理过程。
2.凝血酶可能通过激活凝血酶/RhoA/ROCK通路引起脑出血后组织损伤。