转TaVDAC1和TaRS基因拟南芥抗逆性鉴定

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真核细胞线粒体外膜蛋白中有一类电压依赖性阴离子通道(Voltage-dependent anion channels,VDAC),其在植物生长、细胞凋亡及逆境应激中作用十分关键;高等植物的棉子糖系列低聚糖(raffinose family oligosaccharides,RFOs)不仅在种子的萌发和成熟过程中承担重要角色,还与减轻环境胁迫(包括氧化、高低温、盐渍化和干旱)对植物的影响有关。本实验室前期分别从小麦中克隆获得了电压依赖性阴离子通道基因TaVDAC1和棉子糖合成酶基因TaRS,并且已对两个基因做了生物信息学、亚细胞定位、表达特性等相关的生物学分析,进一步转化拟南芥,筛选至T3代。在此研究基础上,本研究主要内容是对TaVDAC1和TaRS的转基因拟南芥进行抗逆性鉴定,取得的研究结果如下:1、对T3代TaVDAC1转基因株系做了DNA阳性检测,并提取了各阳性株系的RNA,进行q RT-PCR分析后,筛选出了过表达株系OE-3、OE-4与OE-6。2、对NaCl和甘露醇胁迫条件下的萌发率进行了统计,结果表明TaVDAC1转基因株系的萌发率显著高于WT,相反地,其对ABA处理表现出敏感性;对盐、干旱处理下的子叶绿化率进行了统计分析,结果显示TaVDAC1转基因株系的绿化率显著高于WT;NaCl和甘露醇处理下的根长扫描结果显示,TaVDAC1过表达株系的侧根数和总根长显著高于WT,而ABA处理则抑制了TaVDAC1转基因株系的主根生长;此外,转基因株系的叶片还呈现出了黄化表型,结合萌发及根生长的ABA敏感表型,推测TaVDAC1可能参与了ABA信号途径;NBT染色结果表明,在盐处理下,过表达株系体内活性氧含量较低;对离体条件下莲座叶的失水情况进行了测定,结果显示TaVDAC1过表达株系的失水率低于WT;在长期自然干旱后,观察到转基因株系的长势要优于WT;经低温处理后,TaVDAC1转基因株系的存活率较WT高。上述结果表明TaVDAC1提高了拟南芥对盐、干旱和低温的耐受性,而增强了对ABA的敏感性。3、分析了TaVDAC1对部分胁迫标记基因(如RAB18、WRKY28、P5CS1、NCED3、RD29A、COR47、KIN1、COR15A等)表达的影响。结果显示,WT和TaVDAC1过表达株系中胁迫相关基因均响应盐、干旱及冷胁迫而显著上调,但ABA相关的胁迫应答基因在过表达植株中的转录水平普遍低于WT。4、对TaRS转基因拟南芥T3代株系进行了阳性检测,并提取了各阳性株系的RNA进行q RT-PCR分析,筛选到了过表达株系L5-3,L6-4,L7-2。5、统计了NaCl和甘露醇处理下的萌发率,结果表明TaRS过表达拟南芥的萌发率显著低于WT。对盐和干旱胁迫处理下根生长情况进行了观测,结果显示TaRS过表达株系与WT之间没有差异,但过表达株系的鲜重明显小于WT。表明TaRS转基因拟南芥对盐和干旱胁迫的敏感性增强。本实验的研究结果将为阐明TaVDAC1和TaRS的抗逆功能及其胁迫应答作用机制提供实验依据。
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