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红苞凤梨(Ananas comosus var.bracteatus)因其独特的叶色嵌合模式而具有重要观赏价值,是一种重要的新型观赏植物。本课题组己经筛选出导致叶片白化的关键结构基因,继续从microRNA(miRNA)的角度探究其叶色白化失绿的分子机理,能更加深入和全面地阐明绿白嵌合性状形成的分子机理。本文以红苞凤梨三个发育阶段的全白全绿植株为典型材料,进行了小RNA高通量测序,鉴定了红苞凤梨中的miRNA,并对其靶基因进行了预测和功能注释分析。结合miRNA差异表达分析结果和靶基因功能注释,筛选了红苞凤梨白化失绿关键miRNA,并通过构建miRNA超表达载体转化红苞凤梨对其进行功能验证。获得的主要研究结果如下:1、对全白全绿植株叶绿素和类胡萝卜素含量进行了测定,结果表明三个发育阶段的全白植株中都未曾检测到叶绿素,全绿叶片中叶绿素的含量随着叶片的展开和生长而增加。证明全白全绿植株分别是突变白化细胞和正常绿色细胞的典型材料。全白植株类胡萝卜素含量也极显著低于全绿植株,且在叶片展开后差异更加显著。2、通过小RNA高通量测序,从红苞凤梨中鉴定到了163个新的miRNA。其中,104个miRNA具有物种间保守性,59个miRNA不具有保守性。在163个miRNA中,有123个miRNA预测到488个潜在靶基因。其中414个靶基因注释到了Nr,Nt,Swiss-Prot,GO,COG,KEGG,KOG和Pfam数据库。3、构建了全白全绿叶片发育过程中miRNA的表达谱。在叶片未展时,全绿植株绿色不明显,全白全绿叶片间差异表达的miRNA只有29个,而在叶片展开后的第二(4-5片叶)、第三(10-12片叶)发育阶段,全白全绿叶片间差异表达的miRNA分别为65个和69个。在全白和全绿叶片展开后到叶片成熟的过程中,差异表达的miRNA数量分别由80个和91个下降至69个和53个。且在叶片发育成熟的第二阶段到第三阶段的过程中,下调表达的miRNA基因数是上调表达的miRNA基因数的约7倍和5倍。4、采用qRT-PCR对9个差异表达的miRNA及其靶基因的表达水平进行了检测,结果表明miRNA的表达趋势与测序结果呈现很好的一致性,验证了测序结果的可靠性。对miRNA与其靶基因的表达关系进行了分析,只有部分靶基因的表达依赖于miRNA,呈现负调控关系。5、综合miRNA在全绿全白叶片中的差异表达模式和其靶基因的功能分析,最终筛选到了7个红苞凤梨白化失绿关键miRNA:Ab-miR127、Ab-miR160、Ab-miR161、Ab-miR163、Ab-miR6,Ab-miR7和Ab-miR8。Ab-miR127,Ab-miR160,Ab-miR161和Ab-miR163共同靶向联乙烯还原酶基因(DVR),Ab-miR6,Ab-miR7和Ab-miR8靶向PGR-5同源蛋白,参与光系统I周围的循环电子流(CEF)。6、克隆了Ab-miR127,Ab-miR160,Ab-miR161和Ab-miR163的前体序列和其靶基因AbDVR的全长序列,并对其进行了序列分析。结果表明:pre-Ab-miR127缺失了11bp的miRNA成熟序列,是测序预测的假阳性结果;pre-Ab-miR160/161存在60bp左右的缺失,但成熟miRNA序列完整;pre-Ab-miR163与菠萝同源序列的同源性为100%,因此选择pre-Ab-miR163进行功能验证。克隆得到的AbDVR基因全长包含1236bp的开放阅读框(ORF),编码411个氨基酸,其核酸序列与菠萝AcDVR的同源性为100%。7、为了确定红苞凤梨遗传转化潮霉素筛选培养条件,开展了愈伤组织对潮霉素的耐受性试验,发现30mg/L是红苞凤梨愈伤组织的致死浓度,确定了25-30mg/L为红苞凤梨愈伤组织适合的HygB筛选浓度。8、成功构建了UBi-pCAMBIA1301-pre-AbmiR163超表达载体,并转化红苞凤梨愈伤组织。分3批次总共浸染了892颗愈伤组织,经25mg/L HygB和30mg/L HygB各40d的筛选培养,绿白苗筛选获得了43颗抗性愈伤组织。但抗性芽苗生长缓慢,90d的分化培养后,仅11株抗性苗植株株高为2-3cm。转化周期约为200天。后期需要等待抗性植株达到检测苗高后再进行验证。