【摘 要】
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本研究以陆生伊萨酵母WJL-G4（Issatchenkia terricola WJL-G4）为研究对象,对其降解柠檬酸的代谢途径进行探究,致力于为柠檬酸型果汁及其加工产品的生物降酸提供更多的理论依据。将陆生伊萨酵母WJL-G4在不同浓度柠檬酸为主要碳源的培养基中,分别进行静置及摇床发酵,考察培养基中各有机酸的动态变化,进而开展代谢组学研究,根据菌种代谢表型发生的变化以及代谢产物变化趋势,探究陆生
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本研究以陆生伊萨酵母WJL-G4（Issatchenkia terricola WJL-G4）为研究对象,对其降解柠檬酸的代谢途径进行探究,致力于为柠檬酸型果汁及其加工产品的生物降酸提供更多的理论依据。将陆生伊萨酵母WJL-G4在不同浓度柠檬酸为主要碳源的培养基中,分别进行静置及摇床发酵,考察培养基中各有机酸的动态变化,进而开展代谢组学研究,根据菌种代谢表型发生的变化以及代谢产物变化趋势,探究陆生伊萨酵母WJL-G4降解柠檬酸的相关途径,得到的主要结果如下。1、基于高效液相色谱技术建立有机酸检测方法,该方法采用Agilent Poroshell120 EC-C18（4.6×150 mm,4μm）色谱柱,流动相为质量体积比0.5%KH2PO4溶液（p H2.3）-甲醇（97:3,v/v）,进行等度洗脱,流速0.7 m L/min,柱温35℃,检测波长210nm。试验结果表明,在此色谱条件下,乙醛酸、酒石酸、草酰乙酸、苹果酸、α-酮戊二酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸以及没食子酸均得到较好的分离,各有机酸组分的线性范围较宽,相关系数均在0.9992以上,检出限为0.0100-1.0000μg/m L,定量限为0.0400-3.3300μg/m L,加标回收率为87.2096-101.5781%,相对标准偏差最大为4.7690%。2、以陆生伊萨酵母WJL-G4作为试验菌种,选取10、20、60 g/L的柠檬酸培养基为试验组,以葡萄糖代替柠檬酸为对照组,进行摇床及静置培养,探究陆生伊萨酵母降解柠檬酸后培养基中各有机酸的变化。结果表明,试验组中,柠檬酸浓度持续降低,苹果酸、α-酮戊二酸和富马酸均呈现先增后减的变化趋势,但α-酮戊二酸和富马酸在下降过程中出现波动;琥珀酸呈现高低起伏的变化趋势;乙醛酸小幅度上升后下降并趋于平稳;草酰乙酸呈现持续上升随后趋于稳定的变化趋势。对照组中,除柠檬酸呈现先增后减的变化趋势及乙醛酸含量远高于试验组外,其余各有机酸变化与试验组相似。此外,菌种在以柠檬酸为主要碳源的培养基中,当柠檬酸浓度越高,菌种合成琥珀酸、富马酸和草酰乙酸的含量也越高,但琥珀酸和富马酸可被菌体合成并代谢,而草酰乙酸则在发酵液中持续积累。3、以10、60 g/L的柠檬酸培养基为试验组,以同浓度葡萄糖代替柠檬酸为对照组,进行摇床发酵,通过代谢组学研究,对不同培养基中陆生伊萨酵母WJL-G4的细胞内代谢物质进行定性、定量检测及差异分析,结合差异代谢物及代谢通路绘制的各样本组间代谢关系图发现,对照组中,陆生伊萨酵母WJL-G4合成维生素B5受到影响。试验组中,在柠檬酸代谢的过程中产生了较多的亚油酸、α-亚麻酸等脂肪酸类化合物,溶血磷脂酸（16:0/0:0）、溶血磷脂酰胆碱（16:0/0:0）及（16:1/0:0）等磷脂类化合物,表明菌种通过脂肪酸及磷脂类物质的合成以维持酵母细胞的正常生长繁殖,从而应对酸性条件对菌种产生的影响。此外,菌种在降解柠檬酸的过程中,通过三羧酸循环合成α-酮戊二酸并转化为谷氨酸和谷氨酰胺,进而生成嘌呤及嘧啶类化合物,其次还通过C5-支链二元酸代谢生成柠康酸。通过本试验结果推测,陆生伊萨酵母WJL-G4降解柠檬酸过程中,主要通过三羧酸循环代谢大量的柠檬酸,并通过α-酮戊二酸参与谷氨酸、谷氨酰胺代谢进而合成嘌呤及嘧啶类化合物;其次可能通过C5-支链二元酸代谢辅助降解柠檬酸。
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