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小麦是世界上重要的粮食作物之一。由亚洲镰刀菌引起的小麦赤霉病(Fusariu m Head Blight,FHB),在我国的发病面积大、危害重,赤霉病流行不仅引起小麦减产甚至绝产,还产生大量危害人畜健康的毒素,影响食品安全。由于小麦赤霉病天然抗病资源匮乏,抗赤霉病小麦品种培育进展缓慢,因此筛选鉴定抗赤霉病新资源,对于培育抗赤霉病新品种具有重要意义。本研究采取Gateway方法构建了不同亚洲镰刀菌关键生长基因的真菌表达载体,通过RNAi在转录后水平抑制靶基因的表达,筛选能抑制赤霉菌生长发育的片段;并构建了小麦表达载体,为培育抗赤霉病小麦品种提供新材料和依据。1.亚洲镰刀菌二型肌球蛋白合成基因(My2)RNAi片段的分析与鉴定。将Myo 2基因的编码区域共分为15个片段,通过引物将各个片段扩增,并在两端加上attB1/attB2位点。利用BP重组酶与中间载体pDON-201(含有attP1/attP2位点)进行重组,获得BP入门载体。再将入门载体与pSXSH-RNAi载体(含有attR1/attR2位点)利用LR重组酶重组,最终获得具有茎环结构的真菌RNA干扰载体,其中正义链和反义链之间存在一个长度为177 bp的内含子。随后将RNAi干扰表达载体通过PEG介导的原生质体转化,导入亚洲镰刀菌5035菌株,经过同源重组定点整合到其基因组的PLS位点;抗性筛选和表型鉴定发现,转化子Myo2-5、Myo2-6、M yo 2-7、Myo 2-9、Myo 2-12、Myo 2-13、Myo 2-14七个片段菌丝形态和野生型亚洲镰刀菌5035相比有显著差异,菌丝扩展缓慢,气生菌丝稀疏,生长速率受到抑制,说明在这七个片段可有效干扰Myo2基因表达;小麦单花接种所有菌株的结果表明,8 个片段的转化子Myo 2-4、Myo2-5、Myo2-6、Myo 2-8、Myo2-10、Myo 2-12、Myo 2-13和Myo 2-14的致病力显著低于野生型菌株5035;实时荧光定量PCR分析表明,所有RNAi片段的转化子的Myo 2基因表达均显著低于野生型菌株,但是不同片段的干扰效率不同,其中Myo2-5、Myo 2-6和Myo 2-14的干扰作用最强。2.小麦表达载体的构建。选取本研究鉴定的Myo 2-6和实验室前期研究筛选的RNAi片段Chs 7-4,PKC-5,Chs3b-5和Gls-6,与不同组成型及组织特异启动子一起,构建了适用于小麦基因枪和农杆菌介导转化的表达载体;同时构建含不同链接短肽的多基因小麦表达载体,用于小麦遗传转化。