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减数分裂是精子发生中产生单倍体配子的必经环节,不但保证了物种遗传物质的稳定传递,也是遗传多样性产生的重要源泉。在减数分裂过程中,同源染色体之间发生一系列复杂有序的事件,包括配对、联会、重组及分离等,其中重组是减数分裂的核心事件,而配对和联会是为重组的完成提供保障。减数分裂重组是同源染色体上产生程序性DNA双链断裂(DSBs),修复时同源染色体交换遗传信息并最终形成物理连接以利于后期染色体精确分离的过程。性染色体形态与常染色体不同,属于异形染色体,其重组限定在染色体末端很小的区域内,即假常染色体区(PAR)。减数分裂重组异常是引发不孕不育、出生缺陷以及多种遗传性疾病的重要原因,如21三体综合征和克氏综合征(47,XXY)。探究减数分裂重组的关键问题,比如涉及哪些蛋白以及它们如何发挥功能,具有重要的科学意义,然而人们对减数分裂重组,尤其是性染色体重组的认识依然有限。作为“天然模型”的男性生殖障碍患者为我们深入研究精子发生提供了契机。为了发现新的调控精母细胞减数分裂的分子,本论文在睾丸组织学分析的基础上,从中科大人类生殖疾病资源库中挑选出精母细胞发育停滞的患者进行全外显子组测序和生物信息学分析,锁定一个致病候选基因RAD51AP2(RAD51-associated protein 2)存在突变,经T载体单克隆化目标基因结合测序证实该患者为RAD51AP2 复合杂合突变(Exonl:c.943-946delTTTT,p.Lys315Leufs*2;Exon 3:c.3391-3395insTTGGT,p.Arg1131Leufs*19)。本论文制备了两种小鼠 RAD51AP2蛋白的抗体,利用Western blot和荧光免疫染色发现RAD51AP2在小鼠睾丸中特异表达,同时依赖于SPO11介导的DSBs定位在精母细胞染色体轴上;免疫共沉淀(co-IP)结果显示RAD51AP2与重组蛋白RAD51相互作用,这些结果提示RAD51AP2很可能参与减数分裂重组过程。为了确证该患者复合杂合突变是否为致病突变,本论文利用CRISPR/Cas9基因编辑技术制备了Ra 51ap2纯合缺失(Rad51ap2-/-)、Rad51ap2突变(Rad51ap2MUT/MUT)以及携带类似患者突变的复合杂合突变(Rad51ap2*)三种类型的基因修饰小鼠,研究发现这几种修饰小鼠表型一致,雄鼠精子发生均异常。具体表现为生精小管内可见异常的减数第一次分裂中期(MMI)精母细胞,多数MMI细胞存在落后染色体或呈现凋亡状。为了查明原因,本论文利用精母细胞染色体铺展技术结合荧光免疫染色检测了减数分裂前期进程,发现Rad51ap2纯合缺失小鼠常染色体配对、联会和重组过程与对照相似;同时早粗线期XY联会也正常,然而在中粗线期和在双线期分别有51.09%和51.36%的精母细胞XY分离,提示可能是重组修复出现了问题。进一步分析发现Rad51ap2-/-小鼠中重组相关蛋白(如RAD51)持续位于分离的XY PAR区,表明PAR区DSB修复受阻。Co-IP实验进一步证实RAD51AP2通过C端与RAD51相互作用,而在缺失C端4个氨基酸(SRPI)的Rad51ap2MUT/MUT小鼠中RAD51AP2丧失与RAD51相互作用,说明RAD51AP2与RAD51的相互作用对于RAD51AP2募集到染色体轴上发挥功能至关重要。综上所述,本论文发现并证实Rad51ap2是保证性染色体减数分裂重组完成的关键基因,其功能发挥需要与RAD51的互作。RAD51AP2功能丧失不影响常染色体的减数分裂行为,只导致XY PAR区DSB修复失败,XY间的物理连接不能形成,减数分裂不能完成,最终导致精子发生障碍。这些发现提示性染色体DSBs修复与常染色体DSBs修复的机制不同,为人们深入理解减数分裂重组,尤其是性染色体重组过程提供了新思维,也为男性不育的遗传咨询和诊治提供了理论基础。