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谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）不但是当前氨基酸发酵生产的重要工业微生物菌株,而且是研究棒状杆菌代谢调控机制的模式生物。基因编辑技术在微生物育种中发挥着重要作用,但是谷氨酸棒状杆菌ATCC 14067还缺乏有效的基因编辑工具;此外,谷氨酸棒状杆菌L-精氨酸的合成会受到限速酶N-乙酰谷氨酸激酶（CgNAGK）的反馈抑制作用,避免其在体内的过量积累,但是CgNAGK受L-精氨酸反馈调控的机制还尚不清晰。基于此,本研究以谷氨酸棒状杆菌ATCC 14067中的L-精氨酸合成途径为研究对象,首先利用Rec噬菌体来源的重组酶-核酸外切酶对RecET的协助,建立了一种简单、精准、连续的基因敲除系统,并用于其代谢途径的改造;对其合成途径限速酶CgNAGK的别构调控机制进行探讨,并解除产物L-精氨酸对CgNAGK的反馈抑制作用;在此基础上对菌株进行代谢工程改造提高其L-精氨酸的生产能力。具体研究内容及结果如下:（1）基于RecET的基因无痕敲除系统的建立首先在谷氨酸棒状杆菌中探索不同来源的核酸外切酶-重组酶对对外源线性双链DNA（dsDNA）的重组效率;然后选取重组活性最高的核酸外切酶-重组酶对RecET协助外源线性dsDNA的重组为研究对象,通过对dsDNA重组片段的同源臂长度、质量、磷酸化条件的优化,及RecET诱导时间和菌株电击后恢复时间的优化,使RecET在谷氨酸棒状杆菌中对外源dsDNA的重组效率提高了约17倍,且靶标基因的替换效率达94%以上;最后通过建立RecET介导的自我切割线性双链DNA的重组系统（RecET-Cre/lox系统）,实现了ATCC 14067中靶标基因的连续无痕敲除。这为谷氨酸棒状杆菌提供了一种简单、精准、连续的基因敲除工具。（2）L-精氨酸合成途径限速酶CgNAGK反馈调控机制的解析在谷氨酸棒状杆菌L-精氨酸的合成过程中,途径中的限速酶CgNAGK会受到产物L-精氨酸的反馈抑制作用。L-精氨酸结合在精氨酸敏感型NAGK上远离底物催化中心的别构区域,别构调控其底物催化活性。通过同源建模模建CgNAGK六聚体的结构,分析亚基间的疏水作用力,理性指导六聚体结构拆分突变体蛋白的构建,并获得CgNAGK的单体突变体蛋白,V16G、V16E、L17G、L17R和A18K。通过对单体突变体的抑制物L-精氨酸动力学曲线的拟合和酶学性质的分析,发现单体CgNAGK保留对L-精氨酸的敏感性,但是失去了亚基间L-精氨酸别构信号传递的正协同作用;同时,发现单体CgNAGK的比酶活仅为六聚体CgNAGK的10%左右。这表明CgNAGK六聚体的结构是别构信号在亚基间传递及蛋白执行高效催化所必需的,但并不是其别构调控所必需的。通过对CgNAGK的N-helix进行不同长度的截短突变分析,发现2-17位氨基酸缺失的突变体保留对L-精氨酸的敏感性,18-23位氨基酸不同长度的缺失突变体均能降低对L-精氨酸的敏感性;这表明N-helix上的18-23位氨基酸在别构调控中发挥重要作用。通过对E19位氨基酸的定点突变分析发现,E19位氨基酸的亲水性会影响CgNAGK的别构调控作用。将抑制物L-精氨酸对接入CgNAGK的模型,通过分析L-精氨酸与CgNAGK间的相互作用,将不同位置的氨基酸进行不同类型的突变,解析相关氨基酸的功能。通过对突变体蛋白的结构分析和体外突变体蛋白的精氨酸耐受性及酶学性质分析,表明CgNAGK上的W23使L-精氨酸准确定位;L282、T284是L-精氨酸结合空腔形成的骨架氨基酸;E281、L282、T284与L-精氨酸间的氢键作用力在别构调控发挥着不可或缺的作用;并在此基础上提出R209在别构调控中发挥桥梁作用的联动性机制。此外,通过对保守性氨基酸H268进行突变,获得了解除L-精氨酸反馈抑制作用、且底物的催化效率提高了16%的突变体蛋白H268E。（3）L-精氨酸合成途径的代谢工程改造在ATCC 14067中过量CgNAGK突变体蛋白H268E(NAGKH268E),解除途径的反馈抑制作用;基于RecET-Cre/lox基因编辑技术的建立,将L-精氨酸操纵子相关启动子替换为eftu强启动子;并将精氨琥珀酸合成酶（基因argG编码）和精氨琥珀酸裂解酶（基因argH编码）过量表达,增强并优化L-精氨酸的合成途径。过量表达丙酮酸羧化酶（基因pyc编码）,替换icd的启动子为eftu强启动子,增强TCA循环中L-精氨酸合成前体物α-酮戊二酸的供给,进一步地提高L-精氨酸的积累。代谢工程改造后的菌株GHCI-BGHP与出发菌株ATCC 14067相比,在连续发酵培养的条件下L-精氨酸的产量由0增加至11.96 g/L。