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绵羊卵母细胞成熟过程,从GV期至MⅡ中期经历两次阻滞,分别是GVBD前期和MⅡ期中期,一旦通过两次阻滞,即可认定卵母细胞具备受精并发育成个体的能力。显然,两个时期的卵母细胞所受调控基因存在很大差异,但目前所研究的依然较少。因此本试验采用高通量RNA-Seq测序技术针对绵羊GV期和MⅡ中期卵母细胞进行检测,以探究更多未知调控基因以及其参与通路,深入了解差异表达mRNAs/lncRNAs对减数分裂的影响。本试验主要通过收集绵羊GV期裸卵以及体外成熟培养至MⅡ中期卵母细胞,利用免疫荧光反应检测纺锤体变化,并送样进行高通量测序和最终差异表达基因分析。根据实际情况,本研究分为以下四个部分:(1)采集GV期绵羊卵母细胞,共计1292枚,体外成熟培养24h,统计其成熟率为72.14±5.96%。且染色体凝集免疫荧光检测显示GV期卵母细胞核内,染色质呈丝状圆形分布,但并未观察到微管的特异性着色;而MⅡ期卵母细胞染色体和纺锤体均排列在赤道板位置,并有Pb1被排出。(2)测序结果发现:GV期及MⅡ期绵羊卵母细胞RNA文库经质量分析后分别得到81852546、81810992、83912840和83721438、81604688、88526912条clean reads;GV期及MⅡ期绵羊卵母细胞分别有80.52%、80.46%、80.47%和78.64%、80.99%、80.59%的reads匹配到已知基因组。对reads已知类型分析可知:GV期编码蛋白基因约占67.13%,其他功能基因约占31.66%;而MⅡ期编码蛋白基因约占71.20%,其他功能基因约占27.58%。(3)利用GO富集和KEGG富集分析已筛选的mRNA和lncRNA靶基因。结果显示:MⅡ期卵母细胞与GV期卵母细胞相比上调转录本4148条,下调转录本3091条,其中新转录本(Novel isoform)总数444条,MⅡ期细胞与生发泡期细胞相比,绝对上调转录本4条,绝对下调转录本20条;差异表达mRNA的分析结果显示差异表达数5310条,其中绝对上调数16条和上调数1570条,绝对下调数14条和下调数3710条;差异表达lncRNA的分析结果显示差异表达数1485条,其中绝对上调数和上调数分别为42条和913条,绝对下调和下调数为289条和241条。通过cis方式预测差异表达lncRNA的靶基因,在lncRNA基因上下游10K和100K范围内分别预测到7113个和43581个靶基因。差异表达lncRNA靶基因并未出现极显著富集的GO模块;KEGG通路富集分析中有核糖体、内吞作用、泛素介导的蛋白水解、抗利尿激素调节水的重吸收通路显著富集(P<0.05)。差异mRNA出现众多显著富集的GO模块;KEGG通路富集显示剪接体和RNA转运,此外代谢途径通路等通路存在差异(P<0.05)。(4)随机选取差异表达mRNAs和lncRNAs靶基因,运用免疫荧光RT-PCR进行定量分析,结果显示:差异基因定量结果与高通量测斜结果基本一致。总之,本试验首次探讨了存在于绵羊GV期以及MⅡ期两时期大量特异以及差异性表达的mRNA/lncRNAs。这些mRNA/lncRNAs在代谢途径、RNA转运、剪接体、卵母细胞减数分裂、泛素介导的蛋白水解、RNA降解、真核生物核糖体合成、嘧啶代谢、蛋白酶体、氧化磷酸化、代谢途径、同源重组、柠檬酸循序、细胞循环、碳代谢、氨基糖与核苷酸糖代谢通路上的富集程度存在差异性,启示卵母细胞中lncRNAs/mRNAs可能通过参与这些细胞信号通路或生物学过程来调控绵羊卵母细胞减数分裂过程。