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选题依据:远志Polygala tenuifolia是山西省道地药材之一,且全国需求量较大。远志皂苷是远志发挥益智作用的主要活性成分,属于齐墩果烷型五环三萜皂苷,结构复杂,单体化合物远志皂苷价格昂贵,难以获得,限制了该类成分的创新药物研发。酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae在适宜的环境下生长较快,尤其是在大型液体发酵罐中极容易生长,其DNA基因序列已知,故容易进行基因编辑,而且酵母体内具备合成萜类物质所需的前体化合物(2,3-环氧角鲨烯)的能力,该能力使酵母在合成生物学研究中占有了相当大的优势。上述特点使通过改造S.cerevisiae进而实现萜类的异源生物合成成为可能。因此,为了提高远志皂苷的产量,利用S.cerevisiae为底盘细胞进行萜类化合物的异源生物合成研究,是获得远志皂苷的新方法。天然产物的异源合成,为远志皂苷的开发提供了新思路,具体为:通过研究远志中合成远志皂苷的具有催化功能的CYP450(cytochrome P450,CYP450),利用酶切或者同源重组技术构建基因表达盒或者目的片段,导入到具有表达基因的微生物细胞中,就能从微生物的代谢产物中获得所要化合物。研究发现CYP88A85与齐墩果酸合酶(CYP716A249)可能存在着竞争关系,即这2个酶会共同竞争β-香树脂醇为底物,进而催化β-香树脂醇分别生成不同的代谢产物,如11-oxo-香树脂醇和齐墩果酸。因此,如能抑制CYP88A85的表达,将会增加β-香树脂醇的积累,进而提高齐墩果酸的产量。要开展上述研究,首先要鉴定CYP88A85基因的功能,CYP88A85可能以β-香树脂醇为底物,催化β-香树脂醇上的C-11位发生氧化,进而生成11-oxo-香树脂醇。因此,本研究首先对CYP88A85基因进行生物信息分析,然后分析CYP88A85在1-3年生远志的根、茎、叶、花中mRNA表达水平,就可以得到CYP88A85在远志不同年限及不同组织中的表达情况。然后,以课题组自行构建的产β-香树脂醇的S.cerevisiae为底盘细胞,通过引入外源PtCYP88A85基因,得到产11-oxo-香树脂醇的S.cerevisiae菌株,为PtCYP88A85的功能鉴定提供平台。该研究结果将进一步推动远志皂苷生物合成途径的阐明,并为远志皂苷的开发利用奠定基础目的:1.CYP88A85的生物信息学分析,预测CYP88A85的功能;2.CYP88A85在远志中的时、空表达分析,得到CYP88A85在远志1-3年生的根、茎、叶、花组织中的mRNA表达情况;3.研究远志CYP88A85在酿酒酵母体内的功能,为深入了解由β-香树脂醇生成齐墩果酸的代谢途径提供理论依据。方法:1.运用基因分析相关软件及在线生物信息学分析工具对远志CYP88A85基因的核苷酸序列和氨基酸序列,分别进行生物信息学分析。2.通过实时荧光定量PCR分析(Quantitative real time PCR,RT-qPCR)技术检测CYP88A85基因在远志不同发育时间(1-3年)和不同组织(根、茎、叶、花)中的mRNA表达水平。3.基于酶切技术构建细胞色素P450还原酶(Cytochrome P450 reductase,CPR)基因表达盒,采用重叠延伸PCR技术构建PtCYP88A85基因表达盒,采用醋酸锂转化方法,将转入课题组前期已构建的产β-香树脂醇的S.cerevisiae菌株中,进而获得11-oxo-香树脂醇的S.cerevisiae菌株,经气相质谱(GC-MS)检测微生物的代谢物,最终鉴定CYP88A85基因功能。结果:1.目的基因CYP88A85的核苷酸和氨基酸进行生物信息学分析结果显示:CYP88A85为亲水性蛋白,具有稳定性,在远志皂苷合成途径中可能催化β-香树脂醇生成11-oxo-香树脂醇。2.RT-qPCR实验结果显示,CYP88A85在2年生的远志根中表达量最高。3.构建了CYP88A85-CPR表达载体,转入产β-香树脂醇的S.cerevisiae中,得到产11-oxo-香树脂醇的S.cerevisiae菌株。结论:本研究以产β-香树脂醇的S.cerevisiae作为底盘细胞,对远志中的11-oxo-香树脂醇合酶-CYP88A85进行功能研究,并构建了产11-oxo-香树脂醇的11-oxo-香树脂醇菌株,推进了远志皂苷生物合成途径的阐明,为远志皂苷的开发利用奠定基础。