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近年来越来越多的研究发现,恶性肿瘤的发生与细胞凋亡有着密切的联系,现代观点认为肿瘤细胞是因为凋亡机制的丧失而获得无限增殖能力的细胞,放疗、化疗等方法都是通过诱导癌细胞凋亡的方式杀伤癌细胞。恢复肿瘤细胞的凋亡能力已经被认为是一种治疗肿瘤的有效途径。CDK2是细胞周期性蛋白质依赖激酶家族成员之一,它与周期蛋白质CyclinA相结合在细胞周期S期发挥作用。但很多研究表明CDK2同时参与了细胞凋亡的调控过程。在紫杉醇,人参皂苷G-Rh2,TGF-?1以及Etoposide诱导的癌细胞的凋亡过程中,CDK2酶活均发生显著上调,且都为凋亡所必需。一些研究也证明,CDK2在细胞凋亡过程中,会发生由细胞核向细胞浆的转位,且这种转位与CDK2酶活上调相关,并决定了细胞是否发生凋亡。这些实验证明CDK2激酶在细胞凋亡过程中发挥着至关重要的作用,但其具体机制却不清楚。找到CDK2在凋亡过程中的底物可以帮助我们更好的了解细胞凋亡的信号传导通路,进而找到治疗癌症的靶点。Yong Chi的实验证明了N6- (2-Phenylethyl)-ATP (PE-ATP)可以被CDK2(F80A)特异性利用,在PE-ATP上进行化学修饰标记,然后在加入CyclinA/CDK2(F80A)激酶的细胞裂解液中进行酶反应,最终带有标记的蛋白被认为是CyclinA/CDK2的底物。我们期望用这种方法找到细胞凋亡过程中CyclinA/CDK2的底物。我们从Hela细胞的cDNA文库中调取出CDK2基因,构建pCMV-CDK2(F80A)-myc载体,转染Hela细胞,经筛选得到稳定表达突变CDK2(F80A)的细胞系。但稳定细胞系中同时表达了两种CDK2蛋白,这个体系中CDK2的作用可能会发生未知的改变,可能一定程度上影响了细胞周期或细胞凋亡的进程,同时野生型CDK2的存在可能会先将底物的磷酸化位点占据,从而影响我们获得底物信息,为了排除这些因素的干扰,我们同时进行了CDK2(F80A)的knock-in细胞系的建立。我们成功构建了打靶载体,电转染至Hela细胞中,阳性细胞株的筛选工作还在进行当中。总之,我们的工作为今后筛选CDK2细胞凋亡相关底物工作打下了基础。