研究背景:膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤,术后高复发率和对化疗药物的不敏感一直影响着膀胱癌的疗效。单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因转染治疗膀胱肿瘤是目前肿瘤基因治疗的重要策略之一,显示了较好的研究价值和临床应用前景。实验已证实“旁观者效应”即转染阳性细胞使未转染细胞凋亡是TK基因治疗另一重要作用途径,它与基因转染效率被看成肿瘤自杀基因治疗成功的两大关键要素。在目前基因转染效率还不尽如意的情况下,旁观者效应的作用越来越受重视,探讨如何提高旁观者效应是很有意义的。许多实验已证实缝隙连接细胞间通讯(GJIC)是实现旁观者效应主要机理之一。相邻细胞膜上的连接蛋白构成的连接子相互锚定形成中空的连接通道是细胞间通讯的结构基础。然而,在许多肿瘤中,组织特异性连接蛋白表达异常,引起细胞间通讯功能下降,这是自杀基因“旁观者效应”在许多肿瘤中不明显的原因之一。国外许多实验已证实,膀胱移行上皮主要表达连接蛋白Cx26,在调节移行细胞增殖和分化起重要作用。它的异常表达及细胞间通讯功能下降与膀胱肿瘤的发生、发展密切相关。通过提高肿瘤细胞连接蛋白的表达,改善细胞间通讯可望提高自杀基因治疗的旁观者效应。全反式维甲酸(ATRA)是人工合成维生素A衍生物,具有良好的调节细胞间通讯功能的作用,但是,对不同类型细胞的调节作用不同。目前,连接蛋白Cx26在膀胱癌中的表达情况如何,以及ATRA能否调节膀胱癌细胞的GJIC功能,目前的研究极少。实验目的:基于目前的研究现状,我们在本实验中:1、观察膀胱移行细胞癌中Cx26表达情况及生物学意义。2、体外观察ATRA是否有提高HSV-TK/GCV对膀胱癌细胞的旁观者杀伤作用,探讨其作用机理是否与提高Cx26的表达及改善膀胱癌细胞细胞间通讯有关。为联合应用ATRA 和HSV-TK/GCV基因系统治疗膀胱癌提供理论依据。实验方法和结果:1、通过免疫组化观察15例正常膀胱组织标本、35例移行细胞癌组织标本以及体外培养膀胱癌细胞株BIU-87中 Cx26表达情况。Cx26在所有膀胱移行上皮细胞中强<WP=10>表达,主要表达在细胞膜上,而在肿瘤组织中,约68.3%表达降低或不表达,5例异常表达在胞浆或胞核上,Cx26在早期高分化肿瘤中表达降低,且随肿瘤恶性程度增加有降低趋势。在BIU-87细胞系中几乎不表达。RT-PCR测6例正常移行上皮组织和6例肿瘤组织及BIU-87细胞的Cx26 m RNA,并行半定量分析,Cx26 m RNA水平在肿瘤组织和BIU-87细胞株中显著降低(p<0.05)。2、体外观察全反式维甲酸对膀胱癌细胞株BIU-87生长抑制作用,划痕标记染料示踪技术观察ATRA不同浓度不同时相细胞间通讯功能的变化,同时行免疫组化和RT-PCR 观察Cx26表达的改变。结果ATRA 显著抑制细胞生长,促进凋亡,增加连接蛋白Cx26的表达,改善细胞间通讯功能,随剂量增加而增强,呈剂量相关性。3、观察全反式维甲酸处理后的BIU-87细胞对HSV-TK/GCV杀伤作用的敏感性:把BIU-87-TK(+)和BIU-87-TK(-)细胞按不同比例混合培养(BIU-87-TK阳性细胞占总细胞的比例分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0),MTT法观测ATRA对TK基因旁观者杀伤作用的影响,结果经ATRA处理后显著提高TK基因的旁观者杀伤作用(p<0.05),尤其当阳性细胞比例为0.4、0.6时最显著。结 论:在膀胱移行细胞癌中缝隙连接蛋白Cx26表达降低或异常分布,可能是导致细胞间连接通讯功能下降的主要原因,且与肿瘤恶性生物学有密切关系。ATRA可以显著提高HSV-TK对膀胱癌BIU-87细胞的旁观者杀伤作用,可能与通过促进肿瘤细胞Cx26基因转录而提高蛋白表达,改善细胞间连接通讯功能有关。