高灵敏多靶标试纸条的制备及应用研究

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随着食品安全、传染病、心血管疾病和肿瘤诊断需求的不断提升以及“互联网+”的快速成长,传统的检验方式不能很好的满足“在最短的时间内得到准确检验结果”的临床要求,因此简便快速、小型化、高灵敏度的point of care testing(POCT)产品受到了公众的广泛关注。尽管POCT行业和技术发展迅速,上世纪70年代发展起来的侧向层析试纸条(lateral flow assay,LFA)仍然是技术最为成熟,应用最为广泛POCT检测产品,在疾病诊断、食品安全、动植物疫病诊断、环境污染监测等领域有广泛应用。但是目前LFA普遍存在灵敏度低、检测靶标单一,检测耗时较长和定量检测线性范围较窄的技术瓶颈问题,严重制约了POCT技术的革新。表面增强拉曼散射(surface enhanced Raman scattering,SERS)由于具有极高的灵敏度、无需样品预处理、操作简便、检测速度快、准确率高以及不破坏待测样品等优点,在分析化学、生物医学、食品安全和环境卫生监测等领域有着广泛的应用。因此本文开展了基于SERS编码纳米标签的LFA检测体系的构建以及将其应用于多元生物分子检测的研究。本论文的主要研究内容和结论如下:(1)成功制备了三种银核金壳双金属纳米粒子AgMB@Au,AgNBA@Au和AgR6G@Au,其中拉曼染料嵌入银核和金壳纳米粒子的内部间隙中,获得具有稳定编码能力及高拉曼信号强度的SERS编码纳米标签。在785 nm激光激发下,银核半径5 nm,金壳厚度5nm的SERS纳米标签具有最强的拉曼信号。而且不同的SERS纳米标签可以不需要特殊算法而直接根据其独特的拉曼特征峰来区分。通过FDTD仿真模拟显示,随着核壳结构间隙尺寸和金壳的厚度减小,SERS纳米标签的LSPR吸收峰会越来越红移。以红移的吸收峰位置为激发光的波长,得到间隙处的电场强度与金壳外层的电场强度比值最大的电磁场增强。经FDTD仿真计算可得,在785 nm激光激发时,理论计算结果与实验结果一致。这为进一步提高SERS纳米标签的信号灵敏度提供了理论依据,在实际基于SERS纳米标签的多元生物分子检测中具有重要的指导价值。(2)提出了一种基于核壳结构SERS纳米标签(AgNBA@Au)的侧向层析试纸条,实现了心肌标志物的多靶标定量检测,用于急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)的早期诊断。使用SERS纳米标签代替传统试纸条中的胶体金。在试纸条NC膜上构建三条检测(test,T)线,实现对心肌标志物肌红蛋白(Myo)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)和肌酸激酶同功酶(CK-MB)的检测,对Myo、cTnI和CK-MB检测的检测限(limit of detection,LOD)分别为3.2、0.44和0.55 pg mL-1。由于SERS纳米标签的信号放大作用和硝酸纤维素(nitrocellulose,NC)膜的高比表面积,对Myo、cTnI和CK-MB检测的线性动态范围分别为0.01500 ng mL-1、0.0150 ng mL-1和0.0290 ng mL-1,涵盖了人体内Myo、cTnI和CK-MB的临床浓度范围。该方法得到的检测结果与美国FDA(Food and Drug Administration)批准的化学发光法(chemiluminescent immunoassay,CLIA)的检测结果相媲美。且与CLIA相比,定量SERS LFA具有高灵敏、快速、成本低、使用方便、免样品预处理和不需要专业人员操作等的优点。(3)提出了一种基于三种拉曼染料编码的核壳结构SERS纳米标签(AgMB@Au,AgNBA@Au和AgR6G@Au)的新型试纸条,用于在一条T线上快速定量检测三种心肌标志物,对Myo、cTnI和CK-MB检测的LOD值分别为4.2、0.89和0.93 pg mL-1,低于这三种标志物的临床实际浓度。对Myo、cTnI和CK-MB定量检测的线性动态范围分别为0.01500ng mL-1、0.0150 ng mL-1和0.0290 ng mL-1。在17 min内实现了三种AMI标志物的快速高灵敏度定量检测。该方法具有极高的检测灵敏度和较宽的线性动态范围,且试剂消耗少,成本低,制备时间短,实验操作简单,有望在体外诊断中得到广泛的应用。(4)制备了一种基于两种SERS编码纳米标签(AgMB@Au和AgNBA@Au)的新型微阵列试纸条(lateral flow microarray,LFM),用于对多达11种呼吸道感染(respiratory tract infection,RTI)非典型病原体核酸进行超高灵敏度的快速定量检测,实现RTI的早期准确诊断。通过在NC膜上设置2×3的检测T点微阵列,每个T点固定2种病原体核酸捕获探针。反应之后,通过采集T点上的拉曼信号并解码即可实现对11种RTI病原体核酸(influenza A、influenza B、parainfluenza 1、parainfluenza 2、parainfluenza 3、adenovirus、respiratory syncytial virus、chlamydophila pneumoniae、coxiella burnetii、mycoplasma pneumoniae和legionella pneumophila)的定量检测,检测时间仅20 min。利用SERS编码纳米标签的高拉曼信号增强效果以及NC膜的高表面积,对RTI病原体核酸检测的LOD低于0.041 pM,检测的线性动态范围均为1 pM50 nM,覆盖了5个数量级,有望促进RTI的快速筛查,提高临床的诊疗效率。
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