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猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是目前公认的免疫抑制性疾病的病原之一，与猪群发生的多种疾病相关，包括断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDS)及A2型先天性震颤(CT)等。ORF2基因编码的衣壳蛋白(Cap)是PCV2病毒的主要结构蛋白，具有较强的免疫原性，研究表明，去核定位信号的Cap蛋白上存在三个主要的抗原表位，是构建重组疫苗的首选基因。猪白细胞介素-18(Porcine Interleukin-18，PolL-18)作为一种细胞因子，具有很强的IFN-y诱生能力，能促进T细胞增殖和NK细胞活性，在抗微生物感染、免疫调节及免疫治疗等方面发挥作用，尤其可发挥显著的免疫佐剂作用。本研究对Cap/PolL 18融合基因在毕赤酵母中的表达进行了新的尝试，构建了重组表达质粒pPICZaC/Cap/PolL18，并在毕赤酵母中实现了表达。主要研究内容如下：
根据GenBank上己发表的猪IL-18序列和PCV20RF2基因序列，基因的酶切图谱和表达载体多克隆位点的分析，设计并合成了四对引物，在上游引物P1、P3中加入限制性内切酶KpnI，在下游引物P2、P4中加入限制性内切酶Sac II，在P2-L、L-P3引物中加入含15个氨基酸的柔性多肽(Gly4Ser).3的Linker接头。以PCV2 Cap的DNA和PolL-18的cDNA基因组为模板，应用PCR扩增获得Cap和PolL18两个目的基因片段，采用重叠延伸PCR(Overlap extension PCR，SOE-PCR)技术将Cap-Linker和Linker-PolL18基因通过接头连接构建了融合基因。然后将三个目的片断分别克隆到pMD18-T Simple Vector载体中转化大肠杆菌DH5a，经PCR鉴定、酶切鉴定及序列测定，获得的阳性克隆体分别命名为pMD/Cap、pMD/PolL18和pMD/Cap/PolL18。
将上述鉴定正确的三种克隆基因分别亚克隆入酵母表达载体pPICZaC中，转化DH5a宿主菌，经PCR鉴定、酶切鉴定及测序鉴定，构建了重组质粒pPICZaC/Cap、pPICZaC/IL18和pPICZaC/Cap/PolL 18。将鉴定为阳性的重组质粒经.Sac I线性化处理后电击转化感受态的毕赤酵母工程菌X-33，采用抗生素ZeocinTM筛选整合菌株，将筛选获得的高抗性重组酵母菌株通过BMGY/BMMY培养基两步法培养、100％甲醇诱导，诱导上清浓缩后进行SDS-PAGE电泳和Western-blotting分析。
本研究结果表明：成功克隆了去核定位信号的Cap基因(576bp)、PolL 18基因(474bp)及Cap/PolL18融合基因(1095bp)；构建了重组质粒pPlCZaC/Cap、pPICZaC/PolL 18及pPICZaC/Cap/PolL 18;通过毕赤酵母诱导表达筛选出最佳的条件为诱导温度(28℃)、甲醇终浓度(1.0％)、诱导时间(72h)；SDS-PAGE蛋白分析显示在相对分子量为23KDa、18KDa和45KDa左右处分别出现一条蛋白条带，与预期大小一致，而空载体转化宿主菌的对照未发现特异的蛋白条带；Western-blotting分析显示，单表达的蛋白均可发生特异的抗原-抗体反应，Cap/PolL 18融合蛋白能分别与鸡抗猪白介素18抗体和小鼠抗猪圆环病毒阳性血清发生特异的抗原-抗体反应，表明该融合蛋白具有Cap蛋白和PolL 18蛋白的双重反应原性。
本研究结果为下一阶段融合蛋白重组酵母表达质粒pPICZaC/Cap/PolL 18在疾病预防和疫苗佐剂的研制等方面提供一定的理论依据。