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牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)感染引起牛的病毒性腹泻/黏膜病(BVD/MD),给牛养殖业造成重大经济损失。BVDV属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)成员,为单股正链RNA病毒,基因组由5’非翻译区、开放阅读框和3’非翻译区组成,开放阅读框编码一个约4000个氨基酸组成的多聚蛋白前体,在翻译时和翻译后由宿主细胞蛋白酶和/或病毒编码的蛋白酶加工,形成至少11种成熟的病毒蛋白,包括结构蛋白Core、Erns、El、E2和非结构蛋白Npro、p7、NS2-3(NS2和NS3)、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。其中E2是主要的抗原蛋白,能够诱导产生中和抗体。瘟病毒属成员还包括猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)和羊边界病病毒(border disease virus,BDV)等。CSFV感染猪引起猪的高致死性传染病—猪瘟。由于BVDV与CSFV血清学存在交叉反应,给疾病鉴别诊断和防控带来巨大困难。虽然CSFVE2上保守表位研究的报道较多,但BVDVE2的抗原表位序列报道极少。为加深对BVDV E2蛋白抗原表位反应性的认识,本论文基于已有的文献报道和序列分析,选择与CSFV E2蛋白中高度保守抗原表位序列对应、在BVDV E2中氨基酸不同的5个抗原表位,将表位串联重复连接,采用原核表达系统表达、纯化,制备纯化的抗原表位蛋白,对其与E2抗血清的反应性进行分析,旨在为理解BVDV和CSFV感染诱导的血清学交叉反应和发展血清学鉴别检测方法积累数据。以BVDV NADL株基因组RNA为模板,RT-PCR扩增得到BVDV E2基因,再以E2基因为模板PCR扩增得到分别编码E2第1-333位氨基酸和E2第91-333位氨基酸的两个截短的E2基因片段,克隆到原核表达载体pET-32a,构建了重组表达质粒pET/BtE2333和pET/BtE2243。类似地,以携带CSFV E2基因的质粒pUC/CE2为模板,PCR扩增编码第1-177位氨基酸的截短E2基因片段,克隆到pET-28a,构建了重组表达质粒pET/CtE2177。选择BVDV E2蛋白中5个抗原表位序列分别为CKPEFSYAIAKDERIGQLGAEGLT、AEGLTTTWKEYSPGMK、LFDGRKQ、TSFNMDTLA 和 TYRRSKPFPHRQGCITQKNLGE,每个表位进行 6 次重复,用 GSGS柔性肽连接,合成得到编码各重复表位的基因序列,分别连接到加了 6个组氨酸(His)标签的pGEX-6p-1载体上,构建了 5个重组表达质粒,依次命名为pGEX-6E1、pGEX-6E2、pGEX-6E3、pGEX-6E4 和 pGEX-5E5。各种重组表达质粒分别转化E.coli BL21-codon plus(DE3)RIL感受态细胞,用IPTG诱导蛋白表达。经SDS-PAGE和Western blot分析证实,构建的表达质粒分别表达了目的蛋白。经Ni+柱亲和层析纯化,SDS-PAGE电泳分析和蛋白质定量测定,成功制备了高纯度的BVDVE2、CSFVE2蛋白和5个BVDV E2抗原重复表位多肽。用纯化的BVDVE2和CSFVE2蛋白作为抗原,分别免疫BALB/c小鼠,制备了鼠抗BVDV E2和CSFV E2的特异性抗体。免疫荧光染色检测显示,制备的BVDV E2鼠抗血清和CSFV E2鼠抗血清分别能够与BVDV和CSFV感染的PK15细胞发生特异性反应;分别用纯化的BVDV和CSFV作为包被抗原建立的间接ELISA测定显示,血清抗体的效价分别为1:300和1:100。基于优化的间接ELISA方法,分别以纯化的5个抗原表位多肽作为包被抗原,间接ELISA分析了各种抗原表位多肽与鼠抗BVDV E2和CSFVE2特异性抗体的反应性。结果显示,5个重复抗原表位多肽既能够与BVDV E2鼠抗血清反应,也能够与CSFVE2鼠抗血清反应,存在交叉反应。这些工作为理解BVDV和CSFV诱导血清学交叉反应和后续研究BVDV E2与CSFV E2抗原性积累了资料。