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研究背景:海藻与甘草属于十八反反药组合之一,明代陈实功所著《外科正宗》中的海藻玉壶汤中就含有海藻与甘草这对反药,却是临床常用的经典名方,常用于治疗甲状腺肿大、胆囊息肉等。然而反药组合配伍使用涉及到临床用药的安全性以及合理性问题,是关系到国计民生的社会问题。到目前为止,关于反药组合能否配伍使用,虽然有着越来越多的科研人员的重视和参与,并且取得了一定成果,但依然颇具争议。课题组前期开展的国家973计划课题从方药结合的角度对含海藻甘草反药组合的海藻玉壶汤进行研究,分别从海藻甘草反药组合在复方中的不同配伍比例、甘草的不同炮制品种、海藻甘草同一配伍比例下的不同给药剂量等方面展开实验来研究反药组合在复方中应用的特点及规律。后续开展的国家自然科学基金资助项目研究者依据2015版《中华人民共和国药典·一部》(以下简称《中国药典》)中规定的甘草、海藻的使用剂量,分为《中国药典》底限、高限、高限的两倍三个剂量组,从量-毒-效的角度研究海藻不同品种以及海藻甘草不同配伍剂量是否是影响海藻与甘草配伍反与不反的因素,结果显示各配伍剂量组对纠正甲状腺肿大大鼠甲状腺功能各项指标及甲状腺组织形态的效果有差异,筛选出了“效”相对明显的条件:即海藻品种选用海蒿子,甘草使用生甘草,海藻、甘草的剂量选用《中国药典》高限剂量的两倍;在此条件下模型大鼠的心肝肾各项指标与空白组比较没有明显差异,未发现明显毒性。但关于其起效的物质基础以及起效的作用机制方面,仍需进一步探讨。研究目的:本实验基于课题组前期研究成果,进一步探讨在海藻、甘草剂量为《中国药典》高限剂量的两倍(即海藻24g、甘草20g)条件下,海藻与甘草在海藻玉壶汤中的加减应用,从物质基础,下丘脑-垂体-甲状腺轴的调节作用,甲状腺细胞凋亡等方面进行研究,试图揭示其抗甲状腺肿大的机制,以期为完善海藻与甘草反药组合的配伍实质及指导临床应用提供实验依据。研究方法:1物质基础:选择海藻玉壶汤所含中药材的共有成分以及结合文献报道中提到的反药组合对其溶出含量影响较大的成分:橙皮苷(醋青皮、陈皮共有成分);阿魏酸(川芎、当归、独活共有成分);连翘苷;甘草苷、甘草酸(文献报道中提到的反药组合对其溶出含量影响较大的成分)。使用高效液相色谱法作为检测方法,对海藻玉壶汤全方组(以下简称HYD)、海藻玉壶汤减甘草组(以下简称HYD-G)、海藻玉壶汤减海藻组(以下简称HYD-H)、海藻玉壶汤减海藻甘草组(以下简称HYD-GH)、海藻甘草组(以下简称GH)、甘草组(以下简称GC)间相同活性成分溶出含量进行比较。2机制探究:选用健康成年Wistar大鼠,雌雄各半,体重200±20g,分为空白组、模型组、阳性药组(优甲乐)、HYD组、HYD-H组、HYD-G组、HYD-GH组。通过甲状腺病理组织形态方面的变化及检测血液生化指标重点检测甲状腺功能、初步分析成模及药物的起效情况,再通过电镜下观察其微观结构的形态变化以及TUNEL检测凋亡指数后进一步通过蛋白、基因的检测来探究海藻玉壶汤中海藻甘草反药组合加减应用抗甲状腺肿大的作用机制。研究结果:1海藻玉壶汤中海藻甘草反药组合加减对方中主要活性成分溶出含量的影响比较各组中活性成分溶出含量得出:甘草苷、甘草酸在各组中的溶出含量由高到低为HYD-H>HYD>GC>GH;连翘苷、橙皮苷、阿魏酸在各组中溶出含量由高到低为:HYD-H>HYD-GH>HYD-G>HYD。2海藻玉壶汤中反药组合加减对甲状腺肿大模型大鼠下丘脑-垂体-甲状腺轴的影响比较各组大鼠甲状腺系数,光镜下观察大鼠甲状腺组织形态改变,并统计甲状腺组织切片的细胞核数、滤泡面积发现各拆方组间甲状腺组织病理形态改善情况:HYD>HYD-GH>HYD-H>HYD-G。检测甲状腺激素水平三碘甲状腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)、游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)发现海藻玉壶汤及其拆方组均表现出对甲状腺肿大模型大鼠甲状腺激素水平的回调作用,其回调情况从高到低分别为:HYD、HYD-G、HYD-H、HYD-GH;检测甲状腺激素的合成指标并与模型组比较发现HYD组、HYD-G组甲状腺球蛋白(Tg)含量升高,HYD及其各拆方组甲状腺过氧化物酶(TPO)、促甲状腺激素受体(TSHR)水平均降低;检测甲状腺激素的转运指标并与模型组比较发现HYD及其各拆方组甲状腺素结合球蛋白(TBG)、白蛋白(ALB)水平均升高;检测甲状腺激素的调控指标并与模型组比较发现HYD组及其各拆方组促甲状腺激素释放激素(TRH)、促甲状腺激素(TSH)水平均降低,有统计学差异。3海藻玉壶汤中反药组合加减对甲状腺肿大大鼠细胞凋亡及其凋亡通路的影响电镜观察各组细胞微观结构发现,与模型组相比HYD组表现出细胞全面皱缩,细胞核固缩或崩解而弥散在胞浆内,染色质浓缩并边缘化;胞质内粗面内质网减少,线粒体数量减少体积减小,溶酶体数量增多,可见典型的自噬囊泡等凋亡特征,拆方组虽有典型的凋亡特征性变化但凋亡程度不及HYD组。通过TUNEL法检测甲状腺细胞凋亡情况计算凋亡指数发现,与模型组相比,HYD组甲状腺组织凋亡细胞数明显增加,HYD-G组、HYD-GH组未见明显变化,HYD-H组凋亡细胞数明显减少。检测甲状腺组织中Caspase-8、Caspase-9蛋白发现,与空白组相比模型组Caspase-8、Caspase-9水平无明显变化;与模型组比较,给药各组Caspase-8、Caspase-9水平无明显差异。检测Fas、Bcl-2 mRNA发现,与空白组比较模型组Fas、Bcl-2 mRNA表达水平无明显变化;经HYD组及其拆方各组给药治疗后,与模型组比较Fas、Bcl-2 mRNA含量无明显变化。研究结论:1海藻与甘草这对反药组合单独配伍时,表现出引起甘草中甘草苷、甘草酸的溶出含量降低的结果。二者在复方中配伍应用时,甘草苷、甘草酸的溶出含量与甘草组基本持平。而与复方全方组相比,去掉海藻甘草反药组合的拆方组表现出引起甘草苷、甘草酸、连翘苷、橙皮苷、阿魏酸溶出含量升高的结果,可为海藻玉壶汤临床应用及反药组合能否配伍应用研究提供参考。2海藻玉壶汤对甲状腺肿大模型大鼠甲状腺激素水平和组织形态均有改善作用。复方各组比较甲状腺组织病理形态,其改善情况为HYD>HYD-GH>HYD-H>HYD-G;复方各组比较甲状腺激素相关指标水平,其恢复情况为HYD>HYD-G>HYD-H>HYD-GH。在改善甲状腺肿大方面,海藻玉壶汤中反药组合同用的效果优于去反药组合的效果。改善甲状腺肿大的机制与调节甲状腺激素的合成、转运,调控下丘脑-垂体-甲状腺轴有关。3通过电镜微观观察甲状腺细胞及TUNEL法检测甲状腺凋亡指数发现海藻玉壶汤能够促进甲状腺肿大模型大鼠甲状腺细胞的凋亡,全方组促进凋亡的水平强于拆方组。通过分子生物学实验研究发现,本实验中海藻玉壶汤及其拆方促进甲状腺肿大细胞凋亡与Caspase-8、Caspase-9蛋白以及Fas、Bcl-2基因表达无显著相关性,没有统计学差异。