棉花是世界上最主要的经济作物之一,是世界上重要的天然纤维和油料来源。在植棉地区,黄萎病（Verticillium dahliae）对棉花的产量和纤维品质构成严重威胁。棉花黄萎病自发现以来,一直无法得到根治,并且已经成为棉花生产的第一大病害。利用生物信息学和分子生物学的方法来挖掘棉花关键抗病基因,为棉花的抗病育种提供了一条新的途径。在病原体攻击后,防御信号通路即水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）发生活化,进一步导致PR蛋白（Pathogenesis-related proteins）的积累,从而使病原体负荷或病害在未感染的植物器官中最小化。PR5基因在植物抗病过程中起着重要作用,然而,棉花中PR5基因介导的抗黄萎病研究报道偏少。本研究通过生物信息学的方法从全基因组水平挖掘了不同棉种中的PR5家族基因,结合抗病材料Hai7124和感病材料TM-1的组织器官表达及抗病诱导转录组数据,找到了一个棉花PR5家族中关键抗病基因,进一步对这个基因的功能进行了初步研究,具体结果如下:1.棉花全基因组PR5家族基因的挖掘与候选基因鉴定:PR5家族具有一个甜蛋白的结构域。利用该结构域的种子文件PF00314为探针,对已经公布的四个棉种基因组序列进行PR5基因的全基因组鉴定,其中四倍体棉种陆地棉TM-1 90个,海岛棉Hai7124 91个,二倍体棉种亚洲棉48个,雷蒙德氏棉59个。通过分析转录组数据,发现其中4个PR5家族成员在根组织中优势表达,且在Hai7124根中受黄萎病菌显著诱导而在TM-1中不受诱导表达,进一步qRT-PCR验证结果与转录组表达一致。与其他3个基因相比,其中1个PR5基因在根中表达水平较高,且在Hai7124和TM-1中表达差异最大,同源性分析显示该基因与可可中的Osmotin34相似度最高。进一步分析发现,在四倍体陆地棉和海岛棉中位于D亚基因组上。根据其棉种来源,将来源于陆地棉的该基因命名为GhOsmotin34,来源于海岛棉的该基因命名为GbOsmotin34。2.Osmotin34组织器官表达分析与抗病功能分析:通过分析棉花转录组数据,发现Osmotin34主要在棉花根组织中表达,且在抗病材料Hai7124中表达量要显著高于在感病材料TM-1中的表达量,并且在Hai7124中受黄萎病菌的诱导表达。亚细胞定位表明GbOsmotin34主要分布在胞外。通过VIGS技术在Hai7124沉默该基因,与对照相比,棉花的抗病性显著降低。体外抑菌实验表明,在黄萎病菌生长的过程中GbOsmotin34纯化蛋白对真菌孢子有明显的抑制作用,且在黄萎病菌孢子生长的前期抑菌效果更明显。3.Osmotin34抗黄萎病的分子机制:基于海陆棉种之间存在显著表达差异,从Hai7124和TM-1中分别克隆了 1371bp的Osmotin34启动子序列。序列分析显示PGhOsmotin34和PGbOsmotin34在感病材料TM-1和抗病材料Hai7124有一个CCAAT/CCGAT基序的突变,而CCAAT基序为转录因子NFYA结合部位。进一步设计该位点的SNP标记,对239份海岛棉自然群体进行了 PCR扩增检测,发现129份材料是CCAAT,1 10份材料是CCGAT。筛选TM-1中的NFYA家族基因,结合TM-1在黄萎病菌处理不同时间点的表达数据,发现受黄萎病菌处理后显著上调表达的NFYA基因GhD07G2390,命名为GhNFYA5。在提取黄萎病菌诱导的TM-1的根组织cDNA的qRT-PCR定量验证结果表明GhNFYA5在陆地棉中受黄萎病菌诱导上调表达,这与GhOsmotin34在陆地棉材料中受黄萎病下调表达一致。通过设计不同基序与GhNFYA5转录因子结合的酵母单杂实验,发现GhNFYA5会特异地识别CCAAT基序并抑制下游基因的表达。烟草瞬时表达发现,同时注射含有CCAAT基序的启动子和GhNFYA5基因CDS片段的菌液,会明显抑制启动子下游GUS基因的表达。这些结果表明GhNFYA5转录因子确实会在黄萎病菌侵染棉花时通过与GhOsmotin34的启动子基序CCAAT特异性结合来降低该基因的表达量,从而使得海岛棉材料Hai7124和陆地棉材料TM-1表现出不同的抗性。