原始生殖细胞和羊水干细胞培养及生物学特性研究

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本研究成功建立了鸡胚原始生殖细胞(Primordial Germ Cells,PGCs)的体外培养体系,并对其生物学特性进行鉴定。探讨了鸡胚PGCs减数分裂过程及精子发生相关基因表达量的变化。分离培养8 w绵羊的羊水干细胞(Amniotic Fluid Stem Cells,AFSCs)并鉴定其生物学特性,为AFSCs应用于组织工程学及细胞移植治疗提供理论依据。研究发现:1使用在孵化箱中孵化5.5 d的鸡胚进行PGCs的分离。在体视显微镜下小心剥离出鸡胚两侧性腺,剪碎后使用0.125%胰蛋白酶+0.02%EDTA吹打消化,然后接种在培养皿中使用H-DMEM培养,并添加10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS),1 mM丙酮酸钠,1%GlutaMAX,5 ng/mL SCF,5 ng/mL LIF,10 ng/mL b FGF,10 ng/mL IGF等因子促进PGCs的增殖及抑制分化。培养24 h后,可在显微镜下观察到PGCs克隆团的出现,此时的饲养层为鸡胚性腺基质细胞。48 h后显微镜下观察到PGCs克隆团数量增多,体积变大,呈典型的铺路石样。继代培养时使用鸡胚成纤维细胞(Chicken Embryo Fibroblast,CEF)饲养层。无论是CEF饲养层还是鸡胚性腺基质细胞都能够PGCs保持稳定的未分化状态。在本研究中PGCs可在体外连续培养2个月,经AKP和PAS染色鉴定为阳性;形态上PGCs较一般细胞大,折光性强;RT-PCR、免疫细胞化学鉴定(immunocytochemistry)和流式细胞分析(Flow Cytometry,FCM)结果显示,PGCs对生殖细胞及胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell,ESCs)的特异性标志物呈现阳性反应。2鸡胚PGCs在骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins,BMPs)、激活素A(Activin A)和维甲酸(Retinoic Acid,RA)的作用下可启动减数分裂过程,进而在(Bovine Pituitary Extract,BPE)、(Follicle-stimulating hormone,FSH)和睾酮(Testosterone,T)的促进下诱导生成精子。从qPCR结果可证明这些激素促进了PGCs向精子的分化。3在无菌状态下使用注射器抽取8 w绵羊胚胎羊水10 mL,并以1500 rpm的速度离心15 min使细胞富集于离心管底部,最终将细胞接种至12孔板中进行培养,培养基选择DMEM/F12添加10 ng/mL bFGF。羊水中含有多种细胞类型,不同类型的细胞形态也不尽相同。传代时选择长梭形细胞占多数的那一孔进行传代操作。消化条件为0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA于37.5℃培养箱中消化1 min。在经过数次传代细胞纯度较高时,对AFSCs的生物学特性进行鉴定。RT-PCR及免疫细胞化学检测结果显示AFSCs既表达间充质干细胞表面标记物又表达胚胎干细胞特异性标志物。生长曲线实验结果显示AFSCs的增长呈现典型的S型。核型分析结果显示绵羊AFSCs染色体数目为2n=54,形态正常未发生变异。将AFSCs向成脂、成骨、成软骨三个方向进行诱导,特异性染色结果及RT-PCR检测都说明成功诱导生成了脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞。表明AFSCs拥有向三个胚层分化的潜能。
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