本论文基于蛋白质组学分析,第一部分是基于差异蛋白质组学分析了两种不同干燥处理方法对地龙中药材溶栓活性的影响。干燥的地龙作为溶栓药物在我国已有两千余年的历史,关于其溶栓的有效成份及溶栓的作用机理已有较多研究。据报道,从蚯蚓体内分离提取出的一类纤维蛋白溶解酶(又统称蚓激酶)具有纤溶活性或纤溶酶原激活活性、能降低血小板聚集和血浆黏度,因而被认为是地龙溶栓的活性成分。然而,纤溶酶作为蛋白质在地龙的加工干燥过程中很可能会受温度的影响而产生降解,但目前就干燥加工工艺对地龙溶栓活性的影响却未见报道。因此,论文第一部分采用现代生物技术对普通干燥与冷冻干燥两种不同加工处理的地龙进行了比较分析,为今后我国合理加工地龙中药材提供了一定的理论依据。论文第二部分针对特定类别蛋白质,分析了与细胞免疫功能相关的造血丝氨酸蛋白酶的酶切特异性。来自造血干细胞的肥大细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、天然杀伤细胞以及细胞毒性T淋巴细胞的颗粒体中都储存着大量的蛋白酶。在肥大细胞中这些蛋白酶占据了整个细胞蛋白总量的35%,且绝大部分属于胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶家族。目前这些免疫细胞已被证实具有多重免疫调节功能包括诱导细胞凋亡、血压调节、对昆虫以及蛇毒的失活、清除细菌、降解细胞因子等。有关这些细胞的免疫功能调节机制到目前仍不是非常明确,但推测在很大程度上与其胞内的高丰度丝氨酸蛋白酶相关。论文第二部分选择了其中几个造血丝氨酸蛋白酶,分析了它们的酶切特异性。通过对蛋白酶酶切特异性的分析可筛选出它们在体内的潜在底物,进而阐明这些丝氨酸蛋白酶及其细胞的免疫功能调节机制。此外,丝氨酸蛋白酶酶切特异性的分析结合它们的系统进化发育可揭示蛋白酶及其功能在脊椎动物中的进化。本论文主要研究内容和创新性工作如下：(1)基于差异蛋白质组学分析了普通干燥与冷冻干燥两种不同加工方法对中药材地龙溶栓活性的影响及其机理：论文第二章首先采用纤维平板法和血块体外溶解法分别比较分析了普通干燥与冷冻干燥两种不同加工处理地龙的纤溶与溶栓活性。结果表明,冷冻干燥处理得到的地龙具有更强的溶栓活性。接着,我们采用纤维蛋白酶谱法与双向电泳技术对这两种不同加工处理的地龙进行了差异蛋白质组学分析。结果显示,这两种地龙的2-DE蛋白质图谱存在显著的差异。共检测到700多个蛋白质点,其中126个为差异蛋白点。经MALDI-TOF/TOF-MS成功鉴定了83个蛋白质点,其中13个表现为上调或下调,70个为新出现或消失的蛋白质点。这些差异蛋白质点中有5个被鉴定为蚯蚓纤溶酶,2-DE与纤维蛋白酶谱法一致检测到这些纤溶酶在冷冻干燥地龙中的总丰度更高,揭示了冷冻干燥地龙具有更强溶栓活性的机理。综上,本章实验通过分析两种不同干燥处理地龙的差异蛋白质组学,证明了冷冻干燥更有利于保护地龙中溶栓的活性成份。该研究为以后我国合理加工地龙中药材提供了一定的理论指导意义。(2)基于噬菌体展示技术分析了大鼠黏膜肥大细胞蛋白酶(rMCP)-2的酶切特异性,揭示其提高肠道渗透性的机理：大鼠黏膜肥大细胞(MMCs)在肠道受到寄生虫感染后其数量会急剧上升。MMCs内仅包含rMCP-2,-3,-4这三个β-糜蛋白酶,其中rMCP-2含量最高。文献报道,rMCP-2可改变黏膜上皮组织以及血管内皮的通透性,从而有利于其他炎症细胞和血浆组份进入肠腔。因此,推测rMCP-2很可能是MMCs提高对肠道内寄生虫清除这一免疫功能的执行者。但到目前,有关rMCP-2在肠道内的水解底物以及其提高肠道渗透性的机理却不清楚。论文第四章利用噬菌体展示技术与若干新型重组蛋白底物的水解分析完成了对重组rMCP-2延伸酶切特异性的分析。结果显示,rMCP-2的水解位点(P1)偏向芳香族氨基酸Phe或Tyr,而水解肽键上下游相邻位点(P4-P2和P4’-P1’)则普遍偏向脂肪族氨基酸,是一个具有严格底物选择特异性的糜蛋白酶,与小鼠黏膜肥大细胞内的mMCP-1酶切特异性极为相似。根据噬菌体展示技术得到的rMCP-2理论水解序列从大鼠蛋白质数据库中筛选出了rMCP-2在体内的潜在底物。这些潜在底物中,有若干与肠道或血管上皮和内皮细胞紧密连接相关的蛋白。通过对其中5个紧密连接蛋白的重组蛋白与活性rMCP-2的水解分析,鉴定出occludin loop 1、cadherin 17和protocadherin alpha 4能被rMCP-2高效地降解,表明至少以上三个紧密连接蛋白是rMCP-2在大鼠体内的靶标底物,初步揭示了rMCP-2提高肠道渗透性进而增强对寄生虫清除的机理。(3)首次系统地分析比较了人类肥大细胞糜蛋白酶与中性粒细胞组织蛋白酶G的酶切特异性：人类糜蛋白酶(HC)与组织蛋白酶G (hCG)是两个分别来自中性粒细胞和肥大细胞的、极为相似的胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。它们的编码基因都分布在肥大细胞糜蛋白酶基因座,拥有着多种共同的水解底物。因此,人类肥大细胞与中性粒细胞具有相似的促炎、抗炎以及抗菌等多方面的免疫功能。为了明确和区分这两类细胞在炎症方面不同的免疫调节功能,论文第五章基于首次对HC与hCG进行了系统地比较分析。首先,通过噬菌体展示技术与若干新型重组蛋白底物的水解分析比较了这两个造血丝氨酸蛋白酶的酶切特异性。结果表明,hCG与HC具有非常相似的延伸酶切特异性,但HC水解序列在P1位点仅偏向芳香族氨基酸,而hCG P1位点偏向芳香族氨基酸和Leu,反映了HC比hCG具有更严格的糜蛋白酶样酶切特异性。细胞因子是HC与hCG最受关注的潜在底物之一。本章实验分析了重组HC与hCG对50个常见的人类细胞因子/趋化因子的选择性。结果显示,只有3个细胞因子能被重组HC高效降解,10-11个细胞因子能被重组hCG彻底降解,反映了HC与hCG对人类细胞因子或趋化因子均具有高度的选择性,但HC对细胞因子的选择性更强。这些被高效降解的细胞因子在很大程度上可被认为是HC或hCG在体内的潜在靶标底物,因此上述结果直接反映了HC与hCG在炎症反应方面不同的调节作用。(4)首次对负鼠糜蛋白酶基因座的蛋白酶grathepsodenase的酶切特异性进行了分析,揭示颗粒酶B在哺乳动物免疫系统中的进化：Gzm B在哺乳动物体内主要参与诱导半胱天冬酶依赖性的细胞凋亡,是抵抗病毒和胞内细菌的关键调节因子之一。为了鉴定Gzm B的天冬氨酸蛋白酶活性在脊椎动物免疫系统中的进化,阐明半胱天冬酶依赖性细胞凋亡机制在抵抗胞内寄生虫和癌细胞中比非依赖性的细胞凋亡更为重要,论文第六章首次对最原始的非胎盘类哺乳动物——美国负鼠Monodelphis domestica中一个类似Gzm B的蛋白酶grathepsodenase进行了分析。利用HEK 293 EBNA细胞表达合成了该重组蛋白酶,并通过显色底物与新型重组蛋白底物分别分析了grathepsodenase的初级与延伸酶切特异性。结果表明,负鼠grathepsodenase偏向在带负电荷氨基酸的羧基端发生水解,与人类Gzm B具有相似的酶切特异性,属于Gzm B同系物。然而,负鼠Gzm B比人类Gzm B具有更广泛的初级与延伸酶切特异性。非胎盘类哺乳动物中Gzm B同系物的发现暗示着天冬氨酸蛋白酶诱导的半胱天冬酶依赖性细胞凋亡至少在早期哺乳动物时期就已出现并成为哺乳动物免疫系统的组成部分。同时,负鼠Gzm B的发现也说明了糜蛋白酶和Gzm B是肥大细胞糜蛋白酶基因座上两个最早出现的丝氨酸蛋白酶基因。