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本论文从两个部分研究提高动物胚胎生产效率的新技术新方法。
第一部分主要探讨利用免疫抑制素(IHN)-α亚基提高奶牛超排后雌性胚胎产量的可行性。试验选取28头14月龄左右青年荷斯坦奶牛,随机分为高剂量组10头、低剂量组10头、对照组8头。高剂量组首次免疫重组猪IHN-α亚基融合蛋白1mg/头,首次后第28和第56天分别进行加强免疫,剂量为0.5 mg/头,同期对低剂量组进行免疫,免疫原用量为高剂量组的一半,对照组牛同期注射矿物油与生理盐水混合佐剂。在第二次加强免疫后11天,采用FSH四日递减法对三组牛进行超数排卵处理,并根据发情情况用性别分离的雌性精液(含有效精子数2×106个)隔12小时输精两次,在输精后第7天进行收集胚胎。结果显示:主动免疫成功使牛产生了抗IHN抗体。免疫牛在超排后的发情时间发生得比对照组要早(p<0.05),而且高剂量组头均获胚/卵总数、头均可利用胚胎数分别为15.4±1.9枚、5.7±0.7枚,高于对照组的9.1±1.2枚、3.1±0.5枚,差异显著(p<0.05),低剂量组头均获胚/卵总数、头均可利用胚胎数分别是13.0±2.3枚、4.4±0.7枚,与其他两组差异不显著,数值在两者之间。在可利用胚胎中,高剂量组获A级胚胎3.8±1.0枚占头均可利用胚胎数的58%分别高于低剂量组1.2±0.3枚及占可利用胚胎的28%和对照组0.6±0.2枚及占可利用胚胎的19.8%,差异显著(p<0.05)。三组牛的未受精卵、变性胚分别占排卵总数的40%和20%左右。高剂量组优质胚比例高于对照(p<0.05),与其输精后第七天血液孕激素浓度有关。以上结果说明:主动免疫IHN能促进卵泡发育、提高卵巢对超排的反应,在使用X—精子输精后,不仅可以提高雌性胚胎数量,也提高胚胎的质量。
第二部分工作主要探讨利用抗IHN抗体和抗卵泡抑素(FSP)抗体促进体外成熟卵母细胞的发育成熟,以提高卵子体外受精后胚胎发育质量和产量的可行性。先将猪FSP成熟肽30-226氨基酸残基之间的cDNA序列插入原核表达质粒pRSETA,并将重组质粒pR—FSP转入大肠杆菌Ecoli.BL21(DE3)中经IPTG诱导表达理论相对分子量为26.1KD的融合蛋白。该蛋白包含质粒本身的36个氨基酸残基,以及目的片段196个氨基酸残基。将大量表达的FSP重组蛋白经50%Ni—NTA树脂纯化后与矿物油免疫佐剂混合制备FSP免疫原。将以上制备的IHN或FSP免疫原免疫正常健康黄牛,两次免疫后采血并分离血清,用饱和硫酸铵沉淀法获得粗提的抗IHN抗体和抗FSP抗体。将抗IHN抗体和/或抗FSP抗体分别添加在培养猪卵母细胞的成熟液中。卵母细胞在添加10、100μg/mL抗IHN抗体的成熟液中培养后的MⅡ成熟率分别为67.54%、71.09%,显著(p<0.05)高于未添加抗体的对照组的54.81%,卵裂率分别为64.03%、69.42%,显著(p<0.05)高于对照组的45.92%。单独添加抗FSP抗体对卵母细胞的成熟和卵裂率没有影响。但同时添加10μg/mL抗IHN和抗FSP抗体组的卵母细胞MⅡ成熟率为77.97%,极显著(p<0.01)高于对照组54.81%,卵裂率59.32%,显著(p<0.05)高于对照组的45.92%。在添加100μg/mL抗IHN/FSP抗体时MⅡ卵母细胞数的67.20%显著(p<0.05)高于对照组54.81%。
以上结果说明,抗抑制素抗体也能够促进体外培养的卵母细胞在成熟培养后的成熟率,以及胚胎发育质量。而免疫抑制素可以很好地提高奶牛超数排卵处理及用雌性精子输精后的雌性胚胎的生产量和胚胎的质量,免疫抑制素可能通过中和抑制素促进卵泡发育、卵母细胞的成熟和发育质量、以及排卵后形成的更多或更强的黄体功能,促进免疫牛提高超排后胚胎的产量和质量。