甜菜夜蛾几丁质合成酶的表达及初步纯化

来源 :中山大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:luoweitao2007
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  本文以目前重要的农业害虫——甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)为研究对象,根据已克隆的甜菜夜蛾几丁质合成酶全长序列,选择其中保守的催化域片段进行克隆表达。首先根据已知序列设计-对特异性引物,引物序列如下:up--TGTGGATCCCACAGTGACGATGATTCTCAG(下划线部分为BamHI酶切位点),Down--TGCAAGCTTTTGATACCACACCATAGGGC(下划线部分为HindⅢ酶切位点).以实验室存有的克隆到PMD-18T载体上的甜菜夜蛾几丁质合成酶催化域片断(PMD-SeCHS)为模板,进行PCR扩增,将得到的目的大小的片段进行割胶回收,然后进行BamHI和HindⅢ双酶切,将得到的带有粘性末端的片段与经过BamHI和HindⅢ双酶切的pQE30表达质粒进行体外连接,转入大肠杆菌TG1中,筛选菌,提质粒,酶切鉴定后,将其转入大肠杆菌M15中测序鉴定。测序正确的菌液保存,并用IPTG诱导使其表达。结果表明甜菜夜蛾几丁质合成酶片段基因已成功表达。在体外表达了甜菜夜蛾几丁质合成酶催化域片段的基础上,还根据pQE30载体本身带有6-His标签,它能将目的蛋白与6个组氨酸进行融合表达,而Ni-NTA(镍一次氨基三乙酸)树脂对含有六个连续的组氨酸残基的亲和标签-六组氨酸标签(6-Histag)的蛋白的高度选择性,将目的蛋白进行纯化,结果目的蛋白的纯度增加了,可还是有少量的非目的带的出现。但是足以证明了所表达的目的蛋白含有6-His标签,而且可以用来进行酶的活性等的研究。本论文的意义在于将几丁质合成酶的保守片段进行体外表达,并将所获得的蛋白质进行纯化,为筛选新型昆虫生长调节剂奠定基础。   
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