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孕酮撤退引发子宫内膜发生一系列的生物学事件导致子宫内膜发生周期性的剥脱和崩解即月经,它是人和部分灵长类动物和少数其它动物(如蝙蝠)所特有的生理现象。解析子宫内膜周期性的崩解出血机制是理解异常出血和发现应对策略的关键所在,对女性生殖健康具有重要意义。但是孕酮撤退和内膜崩解脱落之间的级联反应通路远未明确,孕酮撤退究竟导致下游被调控基因发生哪些变化还远远没有清楚,其中一个重要原因就是没有合适的动物模型。本实验利用RU486拮抗孕酮撤退建立小鼠月经模型的基础上,对月经发生机制进行一些探讨。
关于月经发生机制研究表明孕酮撤退是月经发生的始动因素,早期研究可以归纳为血管收缩、炎症反应、细胞凋亡等生理反应,进而最终引起MMPs系统降解间质的细胞外基质,从而导致组织的崩解脱落。因为NF-κB是和炎症、细胞凋亡等密切相关的转录因子,推测NF-κB在月经发生过程中起重要作用,进而在小鼠月经模型过程验证这个推论,这对于解析月经的发生机制具有十分重要的意义。对此我们进行了一些有益的探索,结果如下:
1.通过western blot技术首先从整体动物的水平证实了孕酮撤退后,上调了NF-κBp50,p65核蛋白中的表达量并在12h表达量达到最大,激活了NF-κB信号通路。并进一步证实了,孕酮撤退后,可能通过NIK-IKKβ-IκBα上游信号通路激活NF-κB；同时利用免疫荧光的方法在细胞水平证实了,在原代培养小鼠蜕膜化基质细胞模拟孕酮撤退后16h,NF-κB p50和p65入核,即激活NF-κB。
2.选择了NF-κB下游信号分子-MMP家族主要成员MMP1、MMP3、MMP9、MMP10以及环氧合酶-2(COX-2)作为研究的靶分子,从蛋白表达定位、mRNA、蛋白三个水平,以及从整体模型整体动物、小鼠蜕膜化基质细胞、原代培养的人的子宫内膜基质细胞三个层次比较并探讨了RU486拮抗孕酮激活的NF-κB对对这些信号分子的影响。结果表明:
(1)在小鼠模型和蜕膜化小鼠基质细胞中,通过real-time PCR和western blot技术验证孕酮撤退后上调了MMP-13、MMP-3、MMP-9、MMP-10、COX2的mRNA和蛋白的表达,并在撤退后16h,达到峰值。同时下调了MMP-7的表达。
(2)在原代培养的人的子宫内膜基质细胞诱导蜕膜化模拟孕酮撤退,也上调这些信号分子mRNA表达,但峰值出现的时间不同,MMP—1、MMP-9、MMP-10、COX-2在孕酮撤退4d达到峰值,MMP-3在孕酮撤退2d达到峰值。从免疫组化水平,说明了MMP-1(13)/3/9/10和COX-2在月经发生过程中,共定位于即将脱落的基底层区域基质细胞,这种空间和时间上的一致性表明了受NF-κB直接调控的这些信号分子参与了内膜组织的崩解过程。
3.利用NF-κB抑制剂PDTC从整体动物水平观察到部分抑制了子宫内膜的崩解。从分子机制,观察到MMP-1/3/9/10、COX-2的mRNA的表达上调或者下调和。NF—κB的激活和抑制是一致的。同时应用CHIP的方法验证了孕酮撤退后,募集NF—κB p65绑定在MMP-9和COX-2的启动子区并促进MMP-9和COX-2的表达。在蜕膜化小鼠基质细胞和人子宫内膜基质细胞中,通过NF-κB抑制剂MG-132在细胞水平阻断NF—κB信号通路,也观察到这些效应因子相似的调控方式。
4.观察发现在孕酮维持72h后,子宫内膜依然发生崩解,并从蛋白水平发现NF-κB同时被激活,但其下游调控基因MMP-9和COX-2未发生变化,更进一步说明了NF-κB在月经发生过程中的重要性和特殊性。
5.孕酮撤退后,观察到原代培养的人子宫内膜基质细胞发生崩解这一表型。
结论:孕酮撤退激活NF-κB并进一步上调MMP-1(13)/3/9/10和COX-2的表达,提示参与了内膜崩解的过程。