多发性骨髓瘤（Muliple Myeloma）是血液系统的一种恶性肿瘤,和其他恶性肿瘤一样,它的发生、发展与细胞凋亡紊乱有密切关系。CD13是一种细胞膜糖蛋白,又名氨基肽酶N（Aminopeptidase N）,因能够从肽、酰氨和芳酰氨的N端水解氨基酸残基而得名。CD13是最早被认定的正常或恶性髓性细胞的表面标志物,多年来用于对白血病或淋巴瘤细胞的定性和分型。CD13并非仅在髓性细胞才表达,许多其他类型的细胞在其生长周期的某个阶段均可表达CD13。文献表明已检测到骨髓瘤细胞可以高度表达CD13,这为CD13抑制剂乌苯美司靶向治疗多发性骨髓瘤提供了分子生物学的依据。CD13在机体组织细胞之间的生理调节和信号传递过程中起着至关重要的作用,可以水解某些与免疫功能有关的细胞因子,不利于正常免疫功能的发挥。随着对CD13研究的不断深入,越来越多的证据表明,CD13与肿瘤的发生和发展有着密切的关系:CD13可以增强细胞侵袭性,有利于肿瘤转移;可以促进肿瘤新生血管形成;还可促进肿瘤细胞增殖,抑制肿瘤细胞凋亡。CD13抑制剂乌苯美司（Ubenimex）是从网状橄榄链霉菌培养液中发现的一种具有抗菌作用和免疫增强作用的小分子二肽化合物,能抑制肿瘤细胞表面氨基肽酶B.N.和亮氨酸氨基肽酶,诱导肿瘤细胞凋亡和促进宿主免疫功能,具有直接和以宿主为中介的抗肿瘤活性作用。乌苯美司有明确的抗肿瘤活性,早期认为,在体内主要是通过非特异性促进抗肿瘤免疫反应实现的。后来研究发现,体外试验在不含有巨嗜细胞、T细胞等免疫细胞的条件下,乌苯美司仍然可以抑制数种肿瘤细胞生长,促进凋亡。乌苯美司对慢性白血病（CML）细胞株（K562）具有抗增殖和诱导凋亡的作用,抗增殖作用与细胞周期蛋白D1（cyclin D1）表达下降有关,而诱导凋亡机制是通过半胱天冬酶—3（Caspase-3）信号途径和PI3K-GSK信号途径实现的。近年来,国外有少数报道在体外对肿瘤细胞株及白血病细胞株有直接的生长抑制作用,但有关乌苯美司对骨髓瘤细胞的作用研究报道罕见。本实验研究了乌苯美司对人骨髓瘤细胞XG及RPMI8226的抑制作用,观察了乌苯美司是否具有诱导人骨髓瘤细胞凋亡的作用,希望能为寻求多发性骨髓瘤新的治疗手段提供一些线索。实验材料与方法一、实验材料人骨髓瘤细胞株XG及RPMI8226。二、实验方法1、细胞培养两种细胞均常规培养,XG添加浓度为5ng/ml的rhIL-6,3-4天换液传代一次。实验时均用对数生长期细胞。2、药物浓度设定根据预实验及文献报道,设定MTT实验中乌苯美司的终浓度为30ug/ml、125ug/ml、500ug/ml、2000ug/ml。原位细胞凋亡检测及流式细胞仪检测中乌苯美司的浓度均为1000ug/ml。3、细胞生长检测（MTT法）取对数生长期的细胞,新鲜培养液洗后,调整细胞数为1×10⁵个细胞/ml,接种于96孔培养板,每孔100ul,接种同时加不同浓度的药物100ul,每浓度平行6孔,空白对照用等体积的RPMI1640,周围一圈加等体积的PBS液减少边缘效应。置37℃,饱和湿度,含5%CO₂的细胞培养箱培养24、48、72 h。各孔加MTT工作液（5mg/ml）20ul,置37℃细胞培养箱共同培养4 h,取出1000转/分离心10分钟,扣板,加入150ulDMSO,震荡使沉淀充分溶解,混匀。用酶联免疫检测仪（DG3022A型）检测,读取490 nm处的光密度值（0D）,计算抑制率。抑制率（%）=（空白对照的OD值-实验孔的OD值）/空白对照的OD值*100%4、凋亡检测（1）DNA片段原位末端标记（TUNEL）检测凋亡细胞参照原位细胞凋亡检测试剂盒说明书操作。以未经乌苯美司作用的XG细胞做为对照。显微镜观察并拍照。凋亡细胞经DNA片段原位末端标记后,细胞内有淡黄色至棕黄色的颗粒,而未凋亡细胞中则缺。计数3个400倍视野里的细胞,计算凋亡率。凋亡率（%）=凋亡细胞数/总细胞数*100%。（2）流式细胞仪（FCM）检测细胞周期收集未经乌苯美司作用及经乌苯美司1000ug/ml作用48h后的1*10⁶个RPMI8226细胞,经冷PBS洗二次,加入1ml体积分数为70%的乙醇4℃固定过夜,加等量的PBS洗二次,控尽残液。加入PI（5ug/ml）1ml,4℃置30min后上流式细胞仪检测并分析结果。三、统计学分析根据资料性质选用t检验,使用SPSS12.0统计学软件对实验结果进行分析。实验结果1、乌苯美司对人骨髓瘤细胞的生长抑制作用乌苯美司对XG细胞及RPMI8226细胞具有生长抑制作用。不同浓度乌苯美司处理细胞具有不同的生长抑制作用,乌苯美司作用于细胞不同时间,其生长抑制作用也不同。30ug/ml浓度的乌苯美司即可显著抑制XG细胞的生长,与对照组比较,t=8.73,P＜0.01,其在24h的半数抑制浓度(IC₅₀)为1729.8 ug/ml,在48h的半数抑制浓度(IC₅₀)为957.2 ug/ml,在72h的半数抑制浓度(IC₅₀)为630.7ug/ml。而乌苯美司对RPMI8226细胞的抑制作用明显低于XG,30ug/ml浓度的乌苯美司可显著抑制RPMI8226细胞的生长,与对照组比较,t=23.28,P＜0.01,其在24h的半数抑制浓度(IC₅₀)为2454.7 ug/ml,在48h的半数抑制浓度(IC₅₀)为1636.8 ug/ml,在72h的半数抑制浓度(IC₅₀)为1349.0 ug/ml。随作用时间的延长,不同浓度的乌苯美司均使细胞抑制率上升,且随其浓度的增加,上升越明显,可见乌苯美司对细胞的生长抑制作用不断增强,且乌苯美司对XG细胞和RPMI8226细胞的抑制作用均具有剂量-时间依赖关系。2、凋亡检测（1）细胞形态学改变及DNA片段原位末端标记（TUNEL）检测凋亡细胞未经乌苯美司处理的对照组细胞核体积大,完整,胞浆饱满,胞膜连续完整。经乌苯美司1000ug/ml作用48h后的细胞体积缩小,核质固缩,核膜核仁碎裂、溶解,胞质浓缩,出现典型的凋亡小体。光镜下观察,凋亡细胞经DNA片段原位末端标记后,细胞内有棕黄色的颗粒,而未凋亡细胞中则缺如。记数3个400倍视野里的细胞,计算平均凋亡率（%）为50.65%。（2）乌苯美司对细胞周期的影响药物作用导致细胞凋亡形成凋亡小体,导致细胞DNA丢失,在流式细胞仪检测的DNA含量图中,G1期前出现亚G1峰,即所谓的凋亡峰;细胞经乌苯美司1000ug/ml作用48h后,S期细胞比例下降,G2期细胞明显下降,细胞明显阻滞于G1期,提示G1期阻滞是乌苯美司诱导骨髓瘤细胞凋亡的主要原因。讨论乌苯美司最初观察到的生物活性是对细胞膜上的亮氨酸氨基肽酶及氨基肽酶B.N.的抑制作用,由于这种酶的抑制作用对免疫细胞膜产生修饰,从而提高免疫功能,并对数种移植性肿瘤显示了宿主中介的抗肿瘤效果。随后的研究发现,乌苯美司在体外对肿瘤细胞株也有直接的抑制作用。体外试验在不含巨嗜细胞、T细胞等免疫细胞的条件下,乌苯美司仍然可以抑制数种肿瘤细胞生长,促进凋亡。本实验结果显示乌苯美司对XG细胞和RPMI8226细胞的生长抑制作用均具有剂量-时间依赖关系,30ug/ml浓度的乌苯美司作用24h即可显著抑制XG细胞的生长,其半数抑制浓度(IC₅₀)为1729.8 ug/ml。而乌苯美司对RPMI8226细胞的抑制作用明显低于XG,30ug/ml浓度的乌苯美司作用24h半数抑制浓度(IC₅₀)为2454.7 ug/ml,随作用时间的延长,不同浓度的乌苯美司均使细胞抑制率上升,且随其浓度的增加,上升越明显,可见乌苯美司对细胞的生长抑制作用不断增强,且乌苯美司对XG细胞和RPMI8226细胞的抑制作用均具有剂量-时间依赖关系。Kazuhiko等发现乌苯美司对人绒毛膜癌细胞系有生长抑制作用,并与细胞膜上的氨基肽酶N表达呈正相关,认为乌苯美司可能通过抑制氨基肽酶N活性而起作用的。本实验也发现XG细胞对乌苯美司的敏感性远高于RPMI8226细胞,其生长抑制活性可能与CD13（氨基肽酶N）表达具有一定相关性。XG细胞和RPMI8226细胞表面的CD13表达有待进一步检测。迄今,细胞形态学仍是区分凋亡和坏死的最基本和最重要的技术。本实验发现经乌苯美司作用的骨髓瘤细胞具有典型的凋亡细胞的形态学改变,DNA片段原位末端标记（TUNEL）法也检测到阳性的凋亡细胞。流式细胞仪检测的DNA含量分析显示出现亚G1期细胞,即所谓的凋亡细胞,提示乌苯美司对骨髓瘤细胞有生长抑制作用,能诱导细胞凋亡。因此,诱导凋亡是乌苯美司抗肿瘤的重要机制之一。有关乌苯美司诱导细胞凋亡的机制尚不明了。本实验对乌苯美司处理的骨髓瘤细胞进行细胞周期分析显示,RPMI8226细胞经1000ug/ml浓度的乌苯美司作用48h即有G1期细胞比例明显上升,出现G1期细胞阻滞,提示G1期细胞阻滞可能是乌苯美司诱导骨髓瘤细胞凋亡的主要原因。有关乌苯美司诱导骨髓瘤细胞凋亡的途径及信号传递和调控有待进一步研究。结论乌苯美司能明显抑制XG及RPMI8226细胞的生长;其生长抑制作用均具有剂量-时间依赖关系。经乌苯美司作用的骨髓瘤XG细胞具有典型的凋亡细胞的形态学改变,DNA片段原位末端标记（TUNEL）法也检测到阳性的凋亡细胞。流式细胞仪检测RPMI8226的DNA含量分析显示出现亚G1期细胞,即所谓的凋亡细胞,均证实乌苯美司能诱导人骨髓瘤细胞的凋亡。