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背景与目的:缺血性脑卒中（Cerebral Stroke）是临床常见急症,其发病率呈逐年上升趋势。目前对于缺血性卒中的药物治疗主要为及时溶栓并恢复缺血灶的血流灌注。但由于恢复血流后的缺血再灌注损伤（Ischemia-Reperfusion Injury,IRI）往往会造成更严重的脑组织与神经细胞损伤,又进一步成为导致患者不良预后及功能障碍的重要因素。脑缺血再灌注损伤的具体机制至今未明。细胞焦亡（Pyroptosis）这一现象最初是在福氏志贺氏菌感染的巨噬细胞中观察到。这种细胞死亡首先被称为细胞凋亡,因为它与细胞凋亡具有某些共同特征,如:DNA片段化,核固缩且都依赖caspase通路的激活。随着后来对caspase亚型,即caspase-1依赖性细胞程序性死亡研究的逐步深入,学术界发现焦亡与细胞凋亡不同的特点,并认定其为另一种细胞程序性死亡方式。2005年,Susun L首次对caspase-1依赖的细胞死亡进行了单独的定义,并将其正式命名为“细胞焦亡”。细胞焦亡是一种由病原微生物感染或其他危险信号触发的、伴随着炎症反应的程序化细胞死亡,以细胞发生肿胀、裂解和胞质内容物释放为主要特征,而这一系列改变又与上述炎症反应导致的细胞膜通透性改变有关。目前在心脏、肾脏等器官的缺血再灌注损伤中均发现了焦亡现象,但是焦亡在脑缺血再灌注过程中的组织细胞损伤中是否发挥作用至今尚无定论。丙泊酚（Propofol）是一种临床普遍使用的静脉麻醉药物,被广泛应用于全麻过程中的诱导及深度的维持,同时也作为区域麻醉以及临床检查患者镇静所需的镇静剂,应用于无痛胃镜、无痛支气管镜等检查。丙泊酚除了诱导迅速、维持平稳、苏醒快等特点以外,在临床工作中也被发现其在麻醉镇静领域以外,即非麻醉效能的诸多优点。近年来,关于丙泊酚的非麻醉效能研究集中在其抗炎、抗氧化效应上。在炎症调节方面,丙泊酚可以通过抑制内毒素血症中的TLR-4的表达,从而抑制CD14基因的表达及Ik B的磷酸化,减少NF-k B向细胞核内的转移,进而减少血浆和组织中的细胞因子如IL-1β、TNF-a、IL-18等。此外,有研究表明丙泊酚还具有抗氧化,减轻细胞内钙离子超载及中性粒细胞和内皮细胞粘附,调节炎性细胞因子的平衡,直接改善细胞能量代谢障碍等作用。目前的研究认为丙泊酚的保护作用的潜在机制包括抑制促炎因子的激活、对抗氧化应激等。另有研究发现脑损伤模型大鼠的皮质损伤和炎症反应程度与其皮质中NLRP1炎症小体的表达和激活呈正相关。同时丙泊酚可以通过下调NLRP1炎症小体的表达和抑制激活来减轻炎症反应,缓解其对皮质组织的损伤。因此有学者认为丙泊酚有抗炎作用,可以减少发生于中枢神经系统的炎症反应对组织和细胞的损害,但是丙泊酚通过何种机制调节神经系统局部炎症反应,目前尚无明确的研究。因此,本研究旨在通过缺血再灌注损伤（Ischemia-Reperfusion Injury,IRI）的动物模型以及氧糖剥夺复氧复糖再灌注（Oxygen and glucose deprivatiord/Reperfusion,OGD/R）的细胞实验模拟组织与细胞的缺血再灌注过程。通过明确神经组织与神经元细胞在该病理生理过程中炎症反应的激活与细胞焦亡的参与,并探寻潜在的机制。同时通过观察丙泊酚对脑缺血再灌注损伤的保护作用,探索丙泊酚对缺血再灌注神损伤神经元细胞的具体保护机制。方法:1.卒中的动物造模与脑损伤评估:使用大脑中动脉闭塞的方法建立C57BL/6J小鼠脑缺血再灌注损伤（Ischemia-Reperfusion Injury,IRI）的动物模型,采用神经行为学评分评价脑缺血再灌注损伤后小鼠神经行为学变化,并通过TTC染色计算脑梗死体积,湿重/干重法评价脑水肿程度。2.卒中的动物造模脑组织局部炎症的评估:用Realtime-PCR、Western Blot技术检测模拟脑缺血再灌注处理的脑组织中NLRP1炎症小体、cleaved caspase-1及其下游炎症因子cleaved IL-1β、cleaved IL-18的基因和蛋白在不同时间节点的表达变化。使用caspase-1抑制剂Ac-YVAD-CMK抑制caspase-1的活化,研究caspase-1在脑组织与神经细胞缺血再灌注损伤过程中的作用。3.卒中的动物造模脑组织焦亡评估:用Western Blot技术与免疫荧光技术检测焦亡通路激活指示蛋白GSDMD-N蛋白表达水平和在组织中的定位,明确神经组织中存在焦亡情况,使用caspase-1抑制剂Ac-YVAD-CMK抑制caspase-1的活化,探究caspase-1在缺血再灌注神经元细胞焦亡中的关键作用。4.卒中的细胞造模与神经元细胞损伤评估:氧糖剥夺复氧复糖再灌注（Oxygen and glucose deprivatiord Reperfusion,OGD/R）建立缺血再灌注损伤神经元细胞模型,CCK-8法和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）含量测定评估缺氧-复氧处理后小鼠原代神经元细胞活性与LDH含量。观察使用caspase-1抑制剂Ac-YVAD-CMK预处理对OGD/R神经元存活率和LDH含量的影响。5.卒中的细胞造模与神经元细胞炎症评估:用Realtime-PCR、Western Blot技术、ELISA技术检测OGD/R神经元细胞中NLRP1炎症小体、cleaved caspase-1及其下游炎症因子cleaved IL-1β、cleaved IL-18的基因和蛋白在不同时间节点的表达变化。使用caspase-1抑制剂Ac-YVAD-CMK抑制caspase-1的活化,研究caspase-1在神经元细胞OGD/R过程中的作用。6.卒中的细胞造模与神经元细胞焦亡评估:用Western Blot技术检测焦亡通路激活指示蛋白GSDMD-N蛋白表达水平,明确神经元细胞存在焦亡情况,使用caspase-1抑制剂Ac-YVAD-CMK抑制caspase-1的活化,探究caspase-1在OGD/R神经元细胞的关键作用。7.丙泊酚对卒中造模动物的神经保护作用评估:通过神经行为学评分、水迷宫实验、脑梗死体积测定、脑水肿程度测定检测使用丙泊酚干预后对脑缺血再灌注损伤小鼠的神经保护作用。8.丙泊酚对卒中造模动物神经组织炎症反应和焦亡作用评估:使用Western Blot技术检测丙泊酚预处理对IRI小鼠的脑组织中NLRP1炎症小体、cleaved caspase-1及其下游炎症因子cleaved IL-1β、cleaved IL-18和GSDMD-N蛋白表达影响。9.丙泊酚对卒中造模细胞保护作用及机制的探索:沉默NLRP1基因,观察丙泊酚对缺氧-复氧神经元细胞的保护作用,沉默caspase-1基因,在OGD/R和/或丙泊酚干预下,观察神经元细胞焦亡情况,探索丙泊酚对缺氧-复氧神经元细胞影响的机制。结果:1.体内实验结果显示IRI后小鼠神经行为学评分降低,出现脑组织坏死并伴随严重的脑水肿,使用caspase-1抑制剂Ac-YVAD-CMK后神经行为学评分改善,脑梗死灶体积缩小、脑水肿程度减轻。2.小鼠缺血再灌注后发生剧烈炎症反应,焦亡通路的关键因子NLRP1、cleaved caspase-1及其下游的炎症因子cleaved IL-1β、cleaved IL-18在再灌注早期即出现基因和蛋白水平的表达上调,并随时间推移持续升高,在24小时到达到峰值后缓慢下降。使用caspase-1抑制剂Ac-YVAD-CMK可减轻炎症反应。3.小鼠缺血再灌注早期即出现神经元细胞焦亡,并随时间推移逐渐加重,在24小时到到达峰值后缓慢下降,使用caspase-1抑制剂可减轻小鼠脑组织焦亡。4.细胞实验结果显示OGD/R后神经元细胞活性降低、LDH含量增加,使用caspase-1抑制剂Ac-YVAD-CMK后神经元细胞活性升高、LDH含量减少。5.OGD/R后神经元细胞中NLRP1、cleaved caspase-1及其下游的炎症因子cleaved IL-1β、cleaved IL-18在复氧复糖早期即出现基因和蛋白水平的升高,并随时间推移持续升高,在12小时到达到峰值后缓慢下降。使用caspase-1抑制剂Ac-YVAD-CMK可减轻炎症反应。6.OGD/R后神经元细胞中GSDMD-N蛋白在复氧复糖早期即表达上调,并随时间推移持续升高,在12小时到达到峰值后缓慢下降。使用caspase-1抑制剂Ac-YVAD-CMK可减轻神经元细胞焦亡。7.动物实验证实使用丙泊酚后可改善小鼠IRI后的神经行为学评分、学习、记忆能力损伤,可减轻小鼠IRI后的脑水肿程度及脑组织梗死体积。8.丙泊酚预处理可减轻小鼠IRI后NLRP1、cleaved caspase-1及其下游的炎症因子cleaved IL-1β、cleaved IL-18和GSDMD-N蛋白的表达上调。9.丙泊酚预处理逆转了OGD/R神经元细胞中cleaved IL-1β和cleaved IL-18的升高。沉默NLRP1基因后,神经元细胞焦亡减轻、炎症因子表达降低。与正常神经元细胞相比,暴露于OGD/R处理的沉默NLRP1神经元细胞中cleaved IL-1β和cleaved IL-18明显减少。沉默caspase-1基因减弱了丙泊酚对GSDMDN表达和活性的抑制作用,丙泊酚通过NLRP1-caspase-1途径抑制GSDMD的激活,减轻脑缺血再灌注后神经元细胞的焦亡。结论:1.缺血再灌注损伤可引起小鼠神经功能障碍,神经元炎症反应。其过程中发现脑组织损伤与神经细胞NLRP1炎症小体与caspase-1激活介导的神经元焦亡相关。2.丙泊酚可减轻MCAO小鼠脑组织的缺血再灌注损伤,减轻OGD/R后神经元的炎症反应。3.丙泊酚可以通过抑制NLRP1-caspase-1通路抑制神经元OGD/R过程中的细胞焦亡。