膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,表浅性膀胱癌占全部膀胱肿瘤的75%-85%,经过经尿道膀胱肿瘤切除术(TUR-BT)后,5年内复发率可能达70%,并有10%-20%患者可发展为浸润性膀胱癌。肌层浸润性膀胱癌行根治性膀胱切除术后,高达50%的患者会出现转移,5年生存率为36%--54%,针对这部分复发及转移膀胱癌的治疗是泌尿外科的难点和研究方向。很早就有人提出对肿瘤进行“靶向治疗”的新思路,“靶向治疗”的最大好处就在于单克隆抗体针对肿瘤的特异性靶点起作用,治疗效果显著,在杀伤肿瘤细胞的同时基本不损伤正常组织,被认为是未来肿瘤治疗中最具有前景的研究方向。如果能筛选到特异性针对膀胱癌的单克隆抗体,将可能提高复发性、转移性膀胱癌的客观缓解率(ORR)和无疾病进展率。20世纪70年代杂交瘤技术的问世,人们能够制备具有很好特异性的单克隆抗体,但由于这些抗体的异源性,在用于人类疾病的治疗时,会产生人抗鼠抗体反应(HAMA反应)。鼠源单抗即使经过人源化改造,也不可能完全去除抗体的免疫原性,而鼠源抗体的人源化改造本身是个耗时、耗力的工作,经过改造的人源化抗体空间构型可能发生改变,亲和力往往大大下降,同时由于抗体本身的效应功能有限,很难达到预期的作用。为了尽可能减少药用抗体的免疫原性,理想的抗体应为全长人源抗体。抗体库技术使抗体、特别是人源抗体的制备发生了质的飞跃。目前应用最广泛的展示和筛选人源抗体的技术是噬菌体展示技术,该技术不需抗原免疫,可以直接克隆人源抗体基因,将抗体片段与噬菌体的外壳蛋白相融合并展示于噬菌体表面,然后采用相应的抗原对抗体进行富集,通过几轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选,,最后筛选到人源单克隆抗体。但包括噬菌体展示技术、核糖体展示技术、酵母菌展示技术在内的常用的人源抗体展示技术,都没有或者有着与哺乳动物细胞不同的蛋白质折叠和转录后修饰功能,所以其所展示的抗体不能形成正确的三级结构,亲和力往往较低,表达及纯化难度大,且只能筛选到抗体片段(单链抗体可变区片段scFv或者抗原结合片段Fab)而非全长抗体,为了进一步应用,所分离到的scFv必须改造成全长的抗体,用哺乳动物细胞进行表达时,很多改造后的免疫球蛋白G(IgG)分子结合能力都下降。这些问题,大大阻碍了人源抗体的筛选,延缓了人们筛选单克隆抗体用于疾病诊断、治疗的步伐。个理想的用于筛选治疗性抗体的展示系统应该是以哺乳动物细胞为基础,可以提供蛋白质的正确折叠和转录后的修饰功能,而且能够展示全长抗体,所表达的抗体在分子结构、理化性质和生物学功能方面最接近于天然的高等生物功能蛋白质。因此,哺乳动物细胞展示技术是目前最理想的筛选人源抗体的技术。近10余年来,研究者尝试利用哺乳动物细胞表面展示技术用于人源抗体的筛选,通过在重链或者单链抗体的3’端融合血小板衍生生长因子受体跨膜(transmembrane domain, TM)序列,可以在哺乳动物细胞表面展示全长人源抗体或者单链人源抗体,并采用该技术筛选到抗原特异性的抗体。因为抗体库技术扩增的是全套的人源抗体重链跟轻链基因且未经抗原免疫,所以抗体库的多样性越大,从中筛选到高特异性、高亲和力针对特异性抗原的单克隆抗体可能性越大,但目前的哺乳动物细胞表面展示技术所构建的抗体库容量多局限于104-106,抗体库的多样性不足,不能满足筛选高亲和力抗体的要求,这些局限性在很大程度上阻碍了哺乳动物细胞表面展示技术在治疗性抗体研发中的应用。我们在第一部分实验中,成功构建了大容量的膀胱癌特异性的全长人源抗体库,为筛选膀胱癌特异性的、高亲和力的全长人源抗体奠定基础。为了在哺乳动物细胞表面展示全长抗体,抗体的重链和轻链需要同时表达于同个细胞,要达到这个目的,可以采用共转染的方式将重链和轻链表达载体转入细胞,或者将含有双表达框架的载体转入细胞。为了构建用于表达全长抗体的双表达框架载体,第一步需要将重链和轻链插入载体。目前,只能将两个片段分别插入单个的双表达载体中。然而,这是个费时费力的过程,降低了抗体库构建的效率,理想的方法是,可以通过一步连接将重链和轻链插入一个双表达载体中。我们在第二部分实验中,成功构建了双表达载体pDGB4,只需通过一步4片段连接,就可以将抗体的重链全长(或重链可变区)和轻链全长同时插入载体并实现高效连接及在哺乳动物细胞表面的高效表达,可以大大减少抗体库构建的时间,提高筛选效率。第一部分：全长人源膀胱癌特异性抗体库的构建及在哺乳动物细胞表面的展示目的：通过真核表达载体pDGB-HC-TM,构建大容量的、可高效展示于哺乳动物细胞表面的膀胱癌特异性全长人源抗体库基因库,通过单克隆测序和转染哺乳动物细胞后结合流式细胞检测,验证抗体库的质量。方法：采用密度梯度离心法分离膀胱癌患者外周血单核细胞(PBMC),提取总RNA,设计并合成可以扩增全套人IgGl重链可变区和轻链全长的引物,RT逆转录合成cDNA(第1链合成),然后PCR扩增全套IgG1重链可变区基因和轻链全长。采用限制性内切酶BsmBⅠ酶切通过RT-PCR扩增到的IgG1重链可变区,与经过BsmBⅠ酶切的pDGB-HC-TM载体片段(pDGB-HC-TM经BsmBⅠ酶切后去除重链可变区,但仍然含有重链恒定区),在T4DNA连接酶作用下于16°连接过夜,连接产物转化化学感受态细胞TOPO10,在含氨苄青霉素(Amp)的固体培养基上37°培养过夜,根据培养皿上的克隆数计算重链抗体库的库容量,并随机挑取10个单克隆菌落接种过夜,提取质粒DNA送测序,回收其余菌落即为重链抗体基因库。用SfiⅠ酶切通过RT-PCR扩增到的轻链全长和pDGB-HC-TM载体,按同样方法构建轻链抗体基因库,并随机挑取10个单克隆测序。重链库和轻链库随机挑取的单克隆DNA测序结果采用“Vector NTI 10"软件分析是否含正确的编码序列。将测序正确的重链、轻链单克隆的质粒DNA,分别与已知的可表达轻链或者重链的质粒配对共转染12孔板的FCHO细胞,培养48小时后采用相应的荧光标记的抗体染色,结合流式细胞学检测分析细胞表面抗体的表达。结果：共选取10个膀胱癌患者(术后病理确诊),每位患者于术前3天采外周血8-l0ml,共分离1.4×108个外周血单核细胞,分别用RLT裂解后混合。提取总RNA,采用RT试剂盒逆转录总RNA合成cDNA,以逆转录产物cDNA为模板,通过相应的重链、轻链引物扩增相应的片段,经电泳鉴定重链可变区分子量大小约为400kb左右,轻链全长分子量约为700kb左右。回收、酶切相应的片段并插入相应酶切的载体片段,连接产物转化化学感受态细胞TOP010,计算培养皿上的克隆数,我们所构建的重链抗体库库容量为1.7×106,分析鉴定随机挑取的10个重链单克隆的测序结果,其中7个单克隆含有正确的重链可变区编码序列,编码7个特异的氨基酸且序列之间没有重复,将这7个重链单克隆质粒与已知表达轻链的质粒配对共转染FCHO细胞,相应荧光标记的抗体染色后结合流式细胞学检测,均可在细胞表面检测到抗体的表达。采用同样方法,我们所构建的轻链库的库容量为3.1×105,分析鉴定随机挑取的10个轻链单克隆的测序结果,其中9个单克隆含有正确的轻链全长编码序列,编码9个特异的氨基酸且序列之间没有重复,将这9个轻链单克隆质粒与已知表达重链的质粒配对共转染FCHO细胞后,均可检测到抗体的表达。结合单克隆测序和流式细胞分析结果,我们所构建的膀胱癌特异性抗体库库容量为3.32×1011[(1.7×106×70%)×(3.1×105×90%)]。结论：我们采用哺乳动物细胞表面展示技术成功构建了大容量的膀胱癌特异性抗体库,结合单克隆测序和流式细胞检测结果,我们所构建的抗体库库容量高达3.32×1011,为下一步筛选全长人源抗膀胱癌抗体打下良好的基础。第二部分：基于哺乳动物细胞表面抗体展示技术的双表达载体pDGB4的构建目的：设计、构建双表达载体pDGB4,通过4片段连接,可以同时插入重链和轻链基因并快速构建全长人源抗体库,避免了分别构建重链和轻链基因库这个费时费力的过程。方法：设计、合成4组共8个引物,在载体相应的位点引进了合适的限制性内切酶识别序列、扩增相应的4个载体片段：P1和P2扩增5.0 kb框架片段,P3和P4扩增1.6 kb的HC-TM片段(融合了跨膜序列的重链),P5和P6扩增1.8 kb框架片段,P7和P8扩增0.7 kb的轻链片段,电泳鉴定相应片段大小,用相应限制性内切酶酶切,在T4DNA连接酶的作用下,将4个片段进行连接,连接产物转化化学感受态细胞。挑取单克隆进行酶切鉴定,并回收相应酶切片段再进行连接,计算连接效率及无效克隆率。将载体转染FCHO细胞并用相应荧光标记的抗体染色后,通过流式细胞仪检测细胞表面全长人源抗体的表达。将两组PCR扩增得到的人重链可变区抗体库(BsmBⅠ酶切)和人kappa轻链抗体库(SfiⅠ酶切),替代载体两个BsmBⅠ酶切位点之间的重链可变区(0.4 kb的BsmBⅠ片段)和SfiⅠ酶切位点之间的轻链基因(0.7kb的SfiⅠ片段),通过4片段连接,构建两个全长人源抗体库,并各挑取10个单克隆转染FCHO细胞,结合流式细胞检测细胞表面抗体的表达。结果：通过设计的4组相应的引物,分别PCR扩增到预期的0.7kb、1.6kb、1.8kb、5kb大小的4个DNA片段,通过相应的限制性内切酶酶切后,进行4片段连接,连接产物转化TOPO10感受态细胞。挑取4个单克隆进行BsmBⅠ+SfiⅠ双酶切,电泳鉴定均含有预期大小的序列,选择其中一个单克隆(pDGB4)进行5种不同的酶切,都得到了预期大小的片段,可见该克隆含有所有正确的酶切位点。回收两组pDGB4载体经过双酶切后的片段进行连接,均显示了很高的连接、转化效率及很低的背景克隆比例。将pDGB4载体转染FCHO细胞,用相应的荧光标记的抗体进行染色后,结合流式分析既可以分别单独检测到抗体轻链和抗体轻链的表达,也可以同时检测到全长抗体的表达。通过该载体,我们构建了两个105库容量的哺乳动物细胞展示全长抗体库,分别挑取10个单克隆转染FCHO细胞,通过流式细胞分析,分别有8个和6个克隆可以在细胞表面检测到抗体的表达。结论：设计并成功构建了双表达载pDGB4,通过4片段连接同时插入重链和轻链基因,实现全长人源抗体库的快速构建,具有很低的背景值,并实现在哺乳动物细胞表面的高效表达。