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脂质分子在维持细胞膜结构微环境,能量代谢,信号转导等方面上发挥着多种重要的功能,多种脂质相关代谢通路已成为热门的药物靶标。机体的脂质谱的变化也跟机体的生理/病理以及环境等因素密切相关,而新兴的脂质组学研究通过系统研究机体脂质谱的这种变化,揭示生命体的多样性脂质及其生物功能,最终可应用于疾病的早期诊断,病理机制阐明和药物靶标的发现。阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是最常见的神经退行性疾病,其深层次的病因机制尚不明确,且无有效的治疗手段。脑是全身脂质最丰富的器官,且AD的重要诱因之一炎症的发生和多种脂质分子直接相关,近年来AD和脂质代谢紊乱关系的研究报道显著增多。本课题旨在开展基于液相质谱技术的脂质组学方法学研究,利用AD患者生物样本和APP/PS1转基因等模型动物进一步用于探索AD脂质代谢异常和潜在脂质生物标记物。首先,建立了非靶向性和靶向性的脂质组学分析方法。在非靶向性的脂质组学分析方法中,应用甲基叔丁基醚进行二次萃取改进了经典的脂质提取方法,提取浓缩的提取物经超高效液相和高分辨飞行时间质谱仪(HPLC-TOF-MS)分析,同时获得总离子流色谱图(TIC),母离子和子离子质谱图,基于脂质相对分子质量提取的离子流色谱(EIC)峰面积用于脂质定量,母离子和子离子的精确相对分子质量、同位素分布用于鉴定特异的脂质化合物。该非靶向性的脂质组学分析方法可同时分析了血浆中两百种以上脂质分子,这些脂质分子涵盖血浆中含量最高的多种脂质,如磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine),磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine),神经鞘磷脂(sphingomyelin),神经酰胺(ceramide),甘油三酯(triglyceride)和游离脂肪酸(free fatty acids)等。同时本研究还首次对血浆中的多种脂质的离体稳定性进行了考察,发现小鼠血浆中脂质确实存在较明显的稳定性问题,同时推测肝脂酶和血浆酯酶是造成稳定性差的原因,对此我们提出加入PMSF(Phenylmethylsulfonyl fluoride)抑制两种酶从而增加血浆脂质稳定性的方案,保证了后续研究数据的可靠性和重现性。靶向类固醇类脂质的靶向脂质组学分析方法采用高效液相三重四级杆质谱仪(HPLC-QQQ-MS)可同时测定血浆中胆固醇及其合成代谢产物,包括胆固醇(cholesterol),其前体链甾醇(desmosterol),羊毛甾醇(lanosterol)和其外周代谢产物27-羟基胆固醇(27-OH cholesterol),脑内特异性代谢产物24-羟基胆固醇(24-OH cholesterol)。方法学考察显示该分析方法都具有较高的灵敏度,准确度和特异性,能够应用于后续的生物标记物的研究。其次,在所建立的脂质组学分析方法的基础上,分析了AD模型动物的血浆和脑组织样品。结果显示,APP/PS1转基因小鼠血浆中的VLCFA(very long chain fatty acid)和PlsEtn(plasmenylethanolamine)和其对照组相比分别显著上升和下降,而且随着月龄增加,该变化越发明显;APP/PS1转基因小鼠皮层和海马内两类脂质的变化与血浆中变化趋势一致。由于VLCFA的分解代谢和PlsEtn的合成代谢均特异性地发生在超氧化物体(peroxisome)内,两者同时变化提示超氧化物体的表达或其功能发生了变化。进一步研究发现,PPAR-γ(peroxisome proliferator activated receptor gama)的mRNA和蛋白水平在模型小鼠皮层和海马内下调,但在其他脑区无明显变化。结果提示,脑内PPAR-γ的下调导致超氧化物体的生成不足,从而造成了VLCFA的分解代谢和PlsEtn的合成减少。超氧化物体的减少还可能导致AD患者氧化自由基清除功能不足,进而产生氧化应激以及神经毒性,而这是被广泛认可的AD病因之一。最后,为了验证模型动物上的发现并探索潜在的脂质生物标记物,收集了AD患者和认知健康志愿者空腹血浆样品,并对之进行脂质组学分析,发现与模型动物一致的现象,AD患者血浆样品中VLCFA和PlsEtn也分别显著上升和下降。用两类脂质的ROC(receiver operating characteristic)曲线下面积均超过0.9,提示VLCFA和PlsEtn对于区分AD患者和认知健康志愿者有较好的预测性。除VLCFA和PlsEtn的变化外,还发现多不饱和脂肪酸在AD患者血浆中显著下降。此外,进一步发现重组高密度脂蛋白(rHDL)在改善SAMP8小鼠认知功能的同时,也能逆转两类脂质的病理异常变化,提示VLCFA和PlsEtn还有可能作为反映AD药物疗效的生物标记物。本课题成功建立了基于液相质谱技术的全面和可靠的脂质组学定性和定量分析方法,该方法的测定范围能够覆盖机体多种最丰富的脂质种类。应用该技术在AD模型动物和临床血浆样品发现血浆中两类和超氧化物体相关的脂质VLCFA和PlsEtn分别发生了上调和下调,提示血浆中VLCFA和PlsEtn可能是AD潜在生物标记物,PPAR-γ是AD治疗的新靶标之一,上述研究结果为进一步发掘具有诊疗价值的AD生物标记物和药物靶标提供了新的实验依据。