论文部分内容阅读
帕金森病（Parkinson’s disease,PD）作为一种常发于中老年人群的神经系统退行性疾病,其病理特征主要是黑质致密带多巴胺（dopamine,DA）能神经元出现变性脱失以及纹状体内轴突末梢代谢产生的DA含量减少,从而导致病人基底神经节环路功能发生异常,表现出动作迟缓、静止性震颤和肌僵直等多种典型的运动症状,以及痛觉、心血管功能异常、睡眠障碍等多种非运动症状。虽然左旋多巴近几十年来一直被认为是治疗PD最有效的药物,但病人长期服用会出现的耐药性及胃肠道不良反应等仍是棘手的问题。近期有研究报道显示,在未定带（zona incerta,ZI）进行深部脑刺激（deep brain stimulation,DBS）可以高效治疗晚期PD,患者的运动症状可以得到明显改善且无明显的副作用。未定带是位于底丘脑的一个以抑制性γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）能神经元为主的核团,细胞异质性强,除包含GABA能神经元外,还分布有谷氨酸（Glutamic acid,Glu）能、DA能等20多种不同神经递质的神经元。在啮齿类动物中,这些神经元分布在未定带的四个亚区:头端未定带（rostral zona incerta,ZIr）、背侧未定带（dorsal zona incerta,ZId）、腹侧未定带（ventral zona incerta,ZIv）以及尾侧未定带（caudal zona incerta,ZIc）,其中ZId和ZIv是未定带的核心区域。未定带与基底神经节之间存在广泛的纤维投射,且参与机体痛觉感受的调控。尽管临床研究已证实未定带是DBS的安全有效的靶区之一,然而基础机制的研究尚处于起步阶段。未定带中各类型神经元在PD中的病理改变尚不清楚,调控未定带神经元活性如何影响PD运动及非运动症状需要进一步探讨。目的:1.应用6-OHDA及MPTP制备的PD模型小鼠,观察未定带中GABA能神经元等的病理变化。2.应用6-OHDA模型小鼠,观察通过药理学干预激活或抑制未定带对PD小鼠运动及非运动症状的影响。方法:1.通过立体定位技术单侧纹状体注射6-OHDA制备PD模型小鼠;通过连续五天腹腔注射MPTP制备PD模型小鼠。2.利用免疫荧光技术观察PD小鼠未定带中GABA、小清蛋白（parvalbumin,PV）、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS）、酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）等神经元的表达是否发生变化。3.利用立体定位、给药套管植入等技术向6-OHDA诱导的PD模型小鼠的未定带注射GABAA受体拮抗剂Bicuculline或激动剂Etomidate,通过平衡木实验、爬杆实验及旷场实验观察激活或抑制未定带对小鼠运动行为的影响。4.向6-OHDA诱导的PD模型小鼠的未定带注射GABAA受体拮抗剂Bicuculline或激动剂Etomidate,通过Von Frey实验和Hotplate实验观察激活或抑制未定带对小鼠痛觉感受的影响。结果:（一）未定带神经元在6-OHDA诱导的PD模型小鼠中的病理改变腹腔注射阿扑吗啡后,6-OHDA诱导的PD模型小鼠出现健侧旋转行为,而正常对照组则不会出现旋转行为,差异具有统计学意义（P＜0.001）。在6-OHDA诱导的PD模型小鼠中,免疫荧光染色结果显示黑质区TH阳性神经元数目减少,与正常对照组相比,差异具有统计学意义（P＜0.001）;未定带区GABA、NOS、PV等阳性神经元数目减少,与正常对照组相比,差异具有统计学意义(PGABA＜0.001;PPV＜0.05;PNOS＜0.01);未定带区TH阳性神经元数目与正常对照组相比,差异没有统计学意义。（二）未定带神经元在MPTP诱导的PD模型小鼠中的病理改变在MPTP诱导的PD模型小鼠中,免疫荧光染色结果显示黑质区TH阳性神经元数目减少,与正常对照组相比,差异具有统计学意义（P＜0.001）;未定带区GABA、PV、NOS等阳性神经元数目减少,与正常对照组相比,差异具有统计学意义(PGABA＜0.01;PPV＜0.01;PNOS＜0.001);未定带区TH阳性神经元数目与正常对照组相比,差异没有统计学意义。（三）未定带注射Bicuculline或Etomidate对6-OHDA诱导的PD模型小鼠运动症状的影响1.正常小鼠单侧未定带植入给药套管,恢复后进行旷场和爬杆实验。与正常注射生理盐水组小鼠相比,注射GABAA受体激动剂Etodimate后小鼠在旷场中运动的距离显著减少,移动速度明显下降（P＜0.001）,且小鼠并不会出现焦虑症状;爬杆实验中小鼠从杆顶爬到杆底的时间明显延长（P＜0.001）,提示抑制未定带神经元小鼠出现类似PD样运动功能障碍。2.6-OHDA诱导的PD模型小鼠在平衡木实验中的平衡能力显著下降,平均得分为3.533分,与正常对照组相比,差异具有统计学意义（P＜0.001）;未定带注射GABAA受体拮抗剂Bicuculline后小鼠平均得分为4.133分,平衡能力有一定的恢复,与6-OHDA组相比,差异具有统计学意义（P＜0.05）;注射Etomidate后小鼠得分进一步减少至2.933分,平衡能力下降的更严重,与6-OHDA组相比,差异具有统计学意义（P＜0.05）。提示激活未定带神经元能改善小鼠的平衡能力。3.6-OHDA诱导的PD模型小鼠在爬杆实验中的爬行时间明显增加,从杆顶爬行至杆底用时8.222秒,与正常对照组相比,差异具有统计学意义（P＜0.001）;未定带注射Bicuculline后小鼠爬行时间缩短为6.935秒,与6-OHDA组相比,差异具有统计学意义（P＜0.05）;注射Etomidate后小鼠的爬行时间进一步延长为10.21秒,与6-OHDA组相比,差异具有统计学意义（P＜0.001）。提示激活未定带神经元能改善小鼠的协调性。4.6-OHDA诱导的PD模型小鼠在旷场实验中的爬行距离缩短,与正常对照组相比,差异具有统计学意义（P＜0.001）;未定带注射Etomidate后小鼠移动距离进一步减少,移动速度进一步下降,与6-OHDA组相比,差异有统计学意义（P＜0.01）;但是在注射Bicuculline后小鼠移动距离和移动速度虽然有增加的趋势,但是与6-OHDA组相比,并未表现出明显的统计学差异。各组小鼠停留在中心区域的运动时间及在中心区域的运动时间占总运动时间的百分比均无差异,提示小鼠未出现焦虑症状。（四）未定带注射Bicuculline或Etomidate对6-OHDA诱导的PD模型小鼠痛觉感受的影响Von Frey实验和Hotplate实验显示,6-OHDA诱导的PD模型小鼠后肢对机械刺激和热伤害刺激的痛觉感受阈值降低,与正常对照组相比,差异具有统计学意义（P＜0.001）;未定带注射Etomidate后痛觉感受阈值进一步降低(PVon Frey test＜0.05,PHotplate＜0.001),注射Bicuculline则会提高痛觉的感受阈值,与6-OHDA组相比,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:与正常小鼠相比,6-OHDA以及MPTP诱导的PD模型小鼠未定带GABA、PV以及NOS等阳性神经元数目均减少,ZIr的TH阳性神经元数目没有明显差异。正常小鼠未定带注射GABAA受体激动剂Etomidate可诱导小鼠出现PD样运动功能障碍。6-OHDA诱导的PD模型小鼠未定带注射GABAA受体拮抗剂Bicuculline,有助于改善小鼠的运动功能,并提高小鼠对机械性和热刺激的痛觉感受阈值;而注射Etomidate后,PD小鼠的运动功能障碍及痛觉感受敏感性进一步增强。本实验结果为了解未定带神经元在PD中的病理改变以及对PD运动及非运动症状的调控提供了一定的理论依据。