垂体是哺乳动物的内分泌中枢,在维持个体的生长发育、生殖、代谢和内环境稳态等方面发挥重要作用。垂体前叶主要由5种内分泌细胞组成,包括生长激素细胞（Somatotropes）、催乳素细胞（Lactotropes）、促甲状腺素细胞、促性腺激素细胞和促肾上腺皮质激素细胞,其中前三种内分泌细胞共同起源于PIT1阳性的前体细胞。催乳素细胞分泌的催乳素（Prolactin,PRL）在促进乳腺发育、刺激并维持泌乳中发挥关键性作用。催乳素细胞约占成年垂体内分泌细胞总数的20%-50%,在妊娠和哺乳期的雌鼠垂体中占比可以超过50%。催乳素瘤是临床最常见的垂体肿瘤。因此,探究催乳素细胞分化发育及其稳态维持的分子机制不仅具有重要的科学意义,还有潜在的临床价值和应用前景。小鼠是研究垂体发育的常用模式动物。小鼠催乳素细胞的发育晚于生长激素细胞,主要起源于胚胎中晚期出现的生长激素（Growth hormone,GH）细胞谱系。通常认为,GH+PRL+的somatolactotropes是催乳素细胞定向分化早期起始的前体细胞。在出生前后,这种双阳性前体细胞中的一部分开始定向分化为GH-PRL+的催乳素细胞;而双阳性的前体细胞在出生后的垂体中仍然存在并保持一定的增殖活性。催乳素细胞在出生后2-3周经历一个快速扩增期。转录因子ZBTB20是本实验室章卫平教授率先发现并报道的BTB锌指蛋白家族新成员。实验室以往的研究发现,ZBTB20是调控垂体发育以及催乳素细胞发育早期细胞命运特化（cell fate specification）的关键分子。ZBTB20在催乳素细胞前体和5种类型的成熟垂体内分泌细胞中高表达,全身敲除小鼠出生后一过性出现GH+PRL+前体细胞和GH-PRL+细胞完全缺失,催乳素细胞发育完全受阻;同时伴有生长激素细胞增殖受抑、数量减少。机制研究发现,ZBTB20缺失本身并不影响GH+PRL+前体细胞中转录因子PIT1的表达:ZBTB20可直接结合于Prl基因的启动子,并发挥对Prl基因的转录激活作用。随后,国外实验室研究发现ZBTB20通过lncRNA-MIR205HG与PIT1的相互作用,促进Prl基因表达。然而,由于ZBTB20全身敲除小鼠模型的限制,上述研究并不能完全确认ZBTB20是否通过细胞自主（cell-autonomous）作用机制调控催乳素细胞的分化发育,另外,也无法研究ZBTB20是否参与调节出生后催乳素细胞的扩增以及成熟催乳素细胞的正常生理功能。为解决上述科学问题,本课题建立了催乳素引导的ZBTB20诱导型敲除小鼠模型（ZBTB20 Inducible PRL-directed knockout mice,ZB20-IPO）,取得如下研究结果。1、利用CRISPR/Cas9技术,建立Prl-CreER转基因小鼠为分析ZBTB20在不同发育阶段催乳素细胞中的生理功能,我们构建了催乳素细胞特异性、他莫昔芬（Tamoxifen）诱导型的Cre转基因小鼠模型。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,将雌激素受体（estrogen receptor,ER）突变体ERT2与Cre重组酶的融合蛋白CreERT2编码序列引入C57BL/6N小鼠Prl基因第5外显子的终止密码子前,通过P2A病毒短肽连接序列（linker）与PRL编码序列保持同一读框,发挥“同时转录,同时翻译”的作用。在获得的Prl-CreER转基因子代小鼠的催乳素细胞中,经编辑的Prl等位基因在内源性Prl基因转录调控元件的控制下,转录合成编码Prl-P2A-CreERT2的mRNA,同时翻译产生PRL和CreERT2两种蛋白。其中CreERT2在与ERT2的特异性配体他莫昔芬结合后进入细胞核,从而发挥Cre介导的LoxP重组功能。为分析Prl-CreER转基因小鼠的Cre活性及其组织特异性,我们将其与Rosa26-tdTomato荧光报告基因小鼠交配,得到的双杂合子小鼠在他莫昔芬诱导前的垂体中未见明显的tdTomato荧光信号。双杂合子小鼠成年后给予腹腔注射他莫昔芬,诱导结束后10天取材,在垂体中可观察到特异性的tdTomato红色荧光信号,而在垂体以外的其它器官未发现红色荧光信号;进一步通过PRL免疫组化标记,发现垂体中的绝大多数催乳素细胞均表达tdTomato,这些结果表明我们所建立的Prl-CreER转基因小鼠可在垂体催乳素细胞中有效地实现时空限制性基因打靶。2、ZBTB20对生长发育期小鼠催乳素细胞分化发育的调节作用选择出生后生长发育不同阶段的哺乳期幼鼠,尝试经母乳、腹腔注射和灌胃等不同途径给予他莫昔芬,综合母鼠与幼鼠的可耐受性以及诱导效果的稳定性和重复性,确定最佳诱导方案:于出生后第15天开始给予幼鼠他莫昔芬灌胃（75mg/kg）,每天1次,持续5天。诱导结束后第2天取材,Rosa-tdTomato;Prl-CreER小鼠垂体中90%的PRL阳性细胞可见tdTomato荧光信号。ZB20-IPO幼鼠经诱导后,定量RT-PCR结果显示,其垂体中Zbtb20mRNA水平与同窝对照小鼠相比无显著差别,但Prl mRNA水平降低84%;用抗PRL抗体、抗ZBTB20抗体的免疫组化双标结果显示,ZB20-IPO小鼠垂体中约28%PRL阳性细胞为ZBTB20阴性,而对照小鼠垂体中几乎所有的PRL细胞均表达ZBTB20,表明ZBTB20的条件诱导敲除取得了成功。与对照小鼠相比,出生后21天的ZB20-IPO幼鼠垂体中PRL阳性细胞数量无明显差异;与此相一致的是,垂体中催乳素细胞标志分子Drd2的mRNA水平也无显著差异。2小时的EdU掺入标记显示,ZB20-IPO垂体中PRL阳性细胞的EdU掺入率比对照小鼠降低49%,其中PRL+ZBTB20-细胞的EdU掺入率又比PRL+ZBTB20+细胞降低57%,表明ZBTB20的缺失抑制了催乳素细胞的增殖。为探究ZBTB20对催乳素前体细胞分化的调节作用,利用Rosa26-tdTomato小鼠对幼鼠的催乳素前体细胞进行了细胞谱系示踪。在上述他莫昔芬诱导条件下,出生后21天的ZB20-IPO垂体中PRL阳性细胞被tdTomato荧光标记（tdT+）的效率与对照垂体相似,约占PRL 阳性细胞的90%。有意思的是,在对照幼鼠的垂体中,我们发现一群tdT+PRL-的细胞,约占tdT+细胞总数的7.11%,推测其来源于催乳素细胞发育过程中的去分化现象;而在ZB20-IPO垂体中,这群tdT+PRL-细胞占tdT+细胞总数的11.8%,明显高于对照垂体。考虑到催乳素细胞与生长激素细胞在发育过程中的密切关系,我们推测tdT+PRL-细胞是否存在分化为GH细胞的可能性,因此分析了 tdT+PRL-细胞中GH的表达,发现在ZB20-IPO垂体中,tdT+PRL-GH+细胞数量增加至对照组的2倍,提示ZBTB20的缺失可促进PRL+（前体）细胞向生长激素细胞分化。催乳素谱系示踪的免疫标记还显示,ZB20-IPO和对照垂体中均存在tdT+PRL-ACTH+细胞,其数量约占tdT+细胞总数的0.7%,两组间无显著差异。此外,我们还发现无论正常垂体还是ZB20-IPO垂体中都可见少量PRL+ACTH+、PRL+TSH+和PRL+FSH+双阳性细胞。上述结果表明,催乳素细胞在分化发育过程中可能存在去分化的现象,其中小部分细胞可分化为生长激素细胞或促肾上腺皮质激素细胞;另一种可能是TSH细胞在分化过程中存在去分化,此外,也可能存在多种激素共表达的前体细胞。ZBTB20具有抑制催乳素细胞去分化的作用,其缺失可促进去分化细胞转变为生长激素细胞。在正常P21垂体组织中,除了已知的PRLGH双阳性细胞外,PRL与ACTH、TSH和FSH也分别存在共表达的现象。3、ZBTB20对成年小鼠催乳素细胞功能的调节作用给予成年ZB20-IPO及其同龄同性别对照小鼠腹腔注射他莫昔芬（2mg）3次,在诱导结束2天后,免疫组化检测即可发现敲除小鼠垂体PRL+细胞中70%-80%为ZBTB20阴性,而对照小鼠垂体中几乎所有PRL+细胞均表达ZBTB20,表明成熟催乳素细胞表达的ZBTB20蛋白在2天内可完全降解。鉴于成熟催乳素细胞表达的PRL蛋白多以囊泡形式贮存于细胞中、呈脉冲式间歇性释放的特点,我们推测诱导前产生的PRL在细胞中可能维持一段时间,因此动态观察了诱导后小鼠血浆PRL水平。结果显示,从诱导结束后10周开始,雄性ZB20-IPO小鼠血浆PRL水平显著低于对照小鼠。诱导结束后12周取材,与对照组相比,雄性ZB20-IPO小鼠垂体Zbtb20 mRNA水平显著降低、Prl mRNA水平大幅降低,Western印迹显示垂体PRL蛋白水平显著下降,但DRD2的mRNA和蛋白水平均无显著变化;免疫组化染色显示垂体中催乳素细胞的数量正常。雌性ZB20-IPO小鼠经他莫昔芬诱导后血浆PRL水平显著降低,乳腺增生障碍,与正常雄性小鼠交配后,怀孕成功率和第一胎产仔数量并无显著差别,但分娩后哺乳障碍。以上结果表明,ZBTB20对成熟催乳素细胞的Prl基因激活表达具有重要调节作用。综合已有研究,我们得出如下结论:（1）利用所建立的PRL-CreER转基因小鼠,成功建立了催乳素引导的ZBTB20诱导型敲除小鼠模型ZB20-IPO;（2）ZBTB20不仅仅是催乳素细胞前体的细胞命运特化过程中所必需,在出生后生长发育期的催乳素细胞增殖和分化过程中也发挥重要调节作用;催乳素细胞在分化发育过程中存在去分化现象,而ZBTB20对催乳素细胞的去分化以及向生长激素细胞方向的分化具有抑制作用。（3）在成年小鼠的成熟催乳素细胞中,ZBTB20作为Prl基因的转录激活因子,对维持催乳素细胞的PRL表达、分泌等正常生理功能至关重要。总之,本课题的研究明确了 ZBTB20调节催乳素细胞发育的新功能,揭示了垂体催乳素细胞分化发育与功能稳态调控的新机制。