清开灵注射液最初由安宫牛黄丸演化研制而成,可以清热解毒,醒脑开窍,用于治疗邪热内阻,窍闭神昏之病,中风首当其用。其目前应用除脑中风(不论出血、缺血)、心脑血管疾病外,其他系统疾病亦广泛应用如上呼吸道感染、肺炎、肝炎、中毒、肿瘤、传染病等,几乎内外妇儿各种病种皆有使用。原北京中医学院中药系安宫牛黄丸剂改专题研究小组,自1975年开始研制清开灵注射液,至今已逾40年,其临床应用之久,使用范围之广为众多成药所不及。故其疗效或副作用,影响面极广,需要高度重视。疗效自有临床公认,然不良反应报道也日渐增多。除应用不当外,与制剂本身成分复杂、纯化自控较难密切相关,这无疑严重影响其临床应用,也为广大患者安全带来极大隐患。为解决此问题,北京中医药大学相关课题组,继承前辈拳拳之志,汲取临床及药理研究新进展,进而研发试制精制清开灵(JZQKL),以期减毒增效。故精简药物,以明确成分组方,达到质量可控。动物及药理学实验已经证实精制清开灵保留了原清开灵注射液对于缺血性中风的疗效,并且减少了毒副作用。然而尚未有模拟脑缺血缺氧的细胞实验对其疗效及毒性进行验证和评价。此外,随着新的研究进展,原精制清开灵的成分及其比例似乎迫切地有待于重新调整,甚至更换成分。故本课题选择SH-SY5Y细胞,进行氧糖剥夺-复氧复糖(OGD-Rep)以模拟脑缺再灌注损伤,以此OGD-Rep模型检测精制清开灵药效,以期为进一步减毒增效,提供另一角度的证据或参考。本课题上篇对清开灵注射液治疗急性脑中风的临床疗效进行系统评价及Meta分析,对精制清开灵的研究现状进行梳理。下篇为细胞实验研究。主要分三个部分,第一部分主要制作氧糖剥夺的细胞模型(OGD-Rep模型,Oxygen·glucose氧糖剥夺再灌注deprivation/reperfusion);第二部分,药效学研究。主要以细胞活力、细胞损伤测定(CCK-8法、SR1B染色法、LDH测定)对复方及组分分别筛选验证；并根据前一阶段结果尝试新的组方,并对其进行验证；第三部分,最后对新的组方其有效机制进行研究(主要从内质网应激与自噬关系方面)。1目的1.1测定QKL和JZQKL在对正常细胞的毒性(IC50),测定和保护作用及OGD-Rep模型下SH-SY5Y1.2明确JZQKL中黄芩苷等4种成分及TUDCA对正常及OGD-Rep模型下SH-SY5Y细胞的毒性和保护作用,明确其毒性／有效剂量范围1.3根据以上结果调整JZQKL配方,筛选最佳组合,并验证药效1.4研究新组合发挥作用的机制是否与氧化应激、内质网应激及自噬相关2方法2.1模型制作通过Anaeropouch厌氧袋联合无糖DMEM制作OGD-Rep模型。选定OGD12h-Rep2h为主要造模时间,细胞损伤度在50%左右。2.2损伤及药效测定①通过CCK-8法、SRB法、LDH试剂盒测定细胞损伤程度,以前2者为主要依据。②Annexin V-FITC/PI染色,通过流式细胞术检测细胞早中晚期凋亡及坏死情况检测新组方(GT组合)细胞保护作用。2.3机制检测①采用DCFH-DA荧光探针(ROS试剂盒),检测细胞内活性氧水平。②通过吖啶橙、MDC及溶酶体荧光探针Lyso-Tracker对自噬体(自噬溶酶体)进行荧光染色,荧光显微镜下观察,以了解新组方(GT组合)作用是否与自噬相关。③通过Western blot检测BiP/GRP78、CHOP、LC3B、p62等与内质网应激及自噬相关的蛋白表达明确新组方(GT组合)是否通过调节内质网应激而影响自噬进而发挥作用。3结果3.1模型确定选定OGD12h-Rep2h为主要造模时间,细胞损伤度(细胞活力)在50%左右。3.2毒性(IC50测定)①QKL在稀释100～200倍(5000-1万nL/mL)时对正常SH-SY5Y有明显损伤(干预24h)。同样浓度下,未见JZQKL对细胞明显损伤作用。②Gen干预细胞24h后,2000μg/mL高浓度仍发现对细胞活性有损伤,低浓度组CCK-8检测及SRB染色均显示细胞活力增高。③CCK-8法显示BAL在5μg/mL及以上浓度对细胞活性已经有明显损伤,且损伤程度与浓度成正相关。SRB法显示,BAL在100μg/mL及以上浓度细胞数目明显减少。BAL的IC50为114.073μg/mL,95%可信区间为(71.837,184.264)。④CCK-8结果显示,猪去氧胆酸在15.63μg/mL及以上浓度,对细胞活性已经有明显抑制,在7.8μg/mL浓度下OD值已经较正常组降低。SRB法显示在125μg/mL及以上浓度细胞数目明显减少。根据CCK-8结果可得其IC50,为502.989μg/mL,95%可信区间(315.465,1060.9)。⑤CCK-8结果显示,胆酸在125μg/mL及以上浓度,可明显抑制细胞活力：在7.8μg/mL及以上浓度OD已经开始减低。根据CCK-8结果得其IC50为4.66μg/mL,95%可信区间为(1.229,12.725)。⑥CCK-8结果显示,TUDCA1000μg/mL浓度时,可以明显抑制细胞生长,降低细胞活力,在500μg/mL浓度时有损伤的趋势。根据CCK-8结果,TUDCA对细胞的IC50为1955.693μg/mL,其95%可信区间为(1454.846,3147.317)。3.3对模型下细胞作用①在OGD12h-Rep2h模型(损伤中等)下,QKL在6.3～50nL/mL时表现出轻度保护趋势,JZQKL在12.5～100nL/mL时表现出明确的保护作用。在OGD18h-Rep2h模型(损伤重度)下,QKL、JZQKL在25nL/mL时开始表现损伤作用。两者在50～00nL/mL损伤较为明显。细胞损伤加重后,QKL、JZQKL保护作用消失,继而表现出毒性增加。原来部分有保护作用的浓度反而对损伤细胞。②栀子苷对损伤模型细胞具有保护作用,即使在中、重度损伤下依然没有明显毒性作用,甚至高浓度栀子苷250μg/mL、500μg/mL在细胞严重损伤情况下依然对细胞有保护趋势。但细胞保护作用无明显剂量依赖性。③黄芩苷44μg/mL的浓度下,细胞损伤几乎百分之百,不论正常细胞还是模型下细胞。黄芩苷对细胞损伤作用,随着细胞损伤的加重,从44μg/mL到22μg/mL,甚至在10μg/mL以内仍有明显的毒性。④猪去氧胆酸较低浓度约20～60μg/mL开始显示出明显细胞毒性,胆酸则在300μg/mL。TUDCA在500μg/mL浓度范围对细胞的活性影响较HDCA及CA为小,在100μg/mL浓度以下,对细胞活力有增进的趋势。3.4合方效果①栀子苷(62.5μg/mL),黄芩苷与之合用的浓度依次为0.55、5.5、11μg/mL,合用后CCK-8所测细胞活力随着黄芩苷剂量增加而依次下降,SRB法提示细胞数目亦随之下降。②猪去氧胆酸5、10μg/mL与栀子苷合用后则表现细胞活性下降趋势(差异无统计学意义)。③胆酸从5、10、25、50μg/mL分别与栀子苷100μg/mL合用,随着胆酸浓度增加,细胞活性依次下降。④TUDCA与Gen合用未见明显细胞活性抑制作用,在0.5、5两组浓度下对细胞活力有一定提升。3.5合方GT药效验证GT(Gen+TUDCA)组合以栀子苷100μg/mL+TUDCA 5μg/mL组合,CCK-8及SRB法提示TUDCA对Gen细胞保护作用有一定提升(但差异无统计学意义),TUDCA超过50～100μg/mL会减弱Gen的细胞保护作用。流式细胞术Annexin V-FITC染色提示TUDCA可以减少细胞凋亡。3.6机制研究①氧化应激。ROS测定：经过造模损伤后,SH-SY5Y细胞ROS水平升高。GT组荧光强度明显弱于模型组,表明GT组合可以减少损伤细胞的ROS产生。②内质网应激。Tm、SAL对GT药效影响：GT、Tm以及Tm+GT均具有一定细胞保护作用,三者之间相较差异无统计学意义,SAL,未见对损伤细胞的保护或毒性作用,但减弱了GT的药效。Western blot结果：模型组CHOP、Bip、caspasel2及细胞色素C蛋白表达较正常对照组明显增高,GT组则较模型组降低。③自噬。自噬体(自噬溶酶体)染色：a、吖啶橙染色中,模型组及各给药组红色荧光均较正常组深,以模型组最深。其次为GT+Tm。GT与GT+SAL差别不明显。b、 MDC染色中,正常组荧光为弥散状态,模型组可见核周荧光浓聚,而其余各组仅有少量荧光浓度,GT+Tm较GT浓聚点稍增多,GT+SAL组较GT浓聚点亦稍多。c、 Lyso-Traker染色中,正常组溶酶体浓聚明亮颗粒较少,其余各组均较多,而以模型组稍明显,余三组之间差别不大。Western blot结果：模型组Beclin1、LC3B及p62蛋白表达较正常对照组明显增高,GT组则较模型组降低。4结论4.1 QKL与JZQKL比较①对正常细胞,JZQKL细胞毒性小于于QKL②对OGD-Rep模型下细胞,JZQKL较QKL毒性小,保护作用强,但部分浓度JZQKL对细胞的保护作用,在细胞损伤加重时,反而表现出毒性作用。4.2毒性(各药物IC50)①QKL、JZQKL未测出。QKL、JZQKL分别在稀释约1.2万倍(78nL/mL)、3200倍(625nL/mL)时表现出损伤趋势。所测最高浓度1万nL/mL。②栀子苷未测出。在较大浓(2000μg/mL)度范围内,无明显毒性,小剂量范围有促进细胞生长作用。所测最高浓度2000 μg/mL。③黄芩苷IC50为114.073μg/mL,95%可信区间为(71.837,184.264)。④猪去氧胆酸IC50为502.989μg/mL,95%可信区间(315.465,1060.9)。⑤胆酸IC50为4.66μg/mL,95%可信区间为(1.229,12.725)。⑥TUDCAIC50为1955.693μg/mL,95%可信区间为(1454.846,3147.317)。4.3对模型下细胞作用①QKL与JZQKL比较在轻度损伤下,JZQKL细胞保护作用明显强于QKL在重度损伤下,两者均无明显细胞保护作用,细胞毒性增加,QKL毒性大于JZQKL。②栀子苷Gen低中高剂量对不同程度损伤细胞均无明显毒性,常表现出细胞保护作用,其保护作用无明显剂量依赖性。③黄芩苷BAL较低剂量44μg/mL即表现出细胞毒性,随着细胞损伤的加重,其毒性增加。毒性浓度减小。④猪去氧胆酸HDCA较低浓度(20～60μg/mL)开始显示出明显细胞毒性；胆酸(CA)则在300μg/mL;TUDCA在500μg/mL浓度范围对细胞的活性影响较HDCA及CA为小。4.4合方效果①栀子苷与分别与黄芩苷、HDCA、CA合用均会增加细胞损伤,且损伤程度与后三者剂量成正相关。②栀子苷与TUDCA合方,TUDCA剂量5～10μg/mL或以下,不影响栀子苷细胞保护作用,并可减少细胞凋亡。TUDCA高剂量超过50～100μg/mL可减弱Gen细胞保护作用。4.5机制研究①氧化应激OGD-Rep模型可能激发氧化应激反应,并造成氧化应激损伤,GT组合可能通过抑制氧化应激而发挥细胞保护作用。②内质网应激OGD-Rep模型可能激发了细胞内质网应激,GT组合可能在一定程度上降低内质网应激而发挥细胞保护作用。③自噬OGD-Rep模型可能激发了细胞自噬,GT组合可能通过对早期自噬的干预而发挥作用。