细胞连接是存在于多细胞动物细胞间的一种特化结构,多存在于上皮组织。在脊椎动物上皮组织中,主要有三类细胞连接:紧密连接,粘性连接和间隙连接。每一种连接在形态、位置与功能上都各有不同。紧密连接在位置上是这三种连接上最靠近极性上皮细胞顶膜的,也是将相邻的细胞膜连的最为紧密的。功能上紧密连接负责控制小分子和离子在细胞间通路的通过,同时作为屏障阻碍细胞侧膜上膜蛋白在细胞顶膜和基底膜之间的流动从而维持上皮细胞的极性。粘性连接在位置上位于紧密连接之下,对相邻细胞的连接也没有紧密连接那么紧,粘性连接处的细胞间距在10-20纳米。缝隙连接又成为通讯连接,通过由connexin组成六聚体connexon彼此对接形成胞间通道,从而参与突触电信号的传递和胞间营养物质的共享等重要生命活动。ZO1蛋白首先在紧密连接中被发现,它在细胞膜处同构成紧密连接的主要的跨膜蛋白Claudins, occludin以及JAM等都有相互作用,在胞内又同细胞骨架蛋白以及一些核酸结合蛋白相互作用。ZO1在调节紧密连接的建立,细胞内信号的传递方面起着重要作用。同时,在缺乏紧密连接的细胞中也发现了ZO1蛋白,如粘性连接处和缝隙连接处。在粘性连接处,ZO1同链蛋白等粘性连接的主要组成部分catenin等有相互作用;在缝隙连接处,ZO1同多种连接子蛋白connexin相互作用,调节connexin在细胞质和细胞膜之间的分不平衡进而调控缝隙连接斑块的大小。我们的工作中,利用核磁共振波谱学(NMR)的方法解析了人类ZO1蛋白第二个PDZ结构域(ZO1PDZ2)的溶液结构。ZO1PDZ2为结构域交换的二体,通过将二体中每条多肽链N端的20个残基彼此交换形成非常稳定的同二聚体。这种同二聚体保留了PDZ结构域同配基相互作用所学要的位于α2与β2之间的疏水口袋。我们利用NMR化学位移扰动的方法以及等温量热实验进一步研究了ZO1PDZ2同其配基的相互作用,发现ZO1PDZ2表现出了II型PDZ结构域的结合特征,选择C端0位和-2位为疏水氨基酸残基的小肽相互作用。同时,我们确认了Cx45可以通过它的C端同ZO1相互作用,并将之前认为的Cx45的作用范围,即PDZ1-PDZ2精确到了PDZ2。此外,我们还发现ZO1PDZ2可以同Cx25和Cx59的C端小肽相互作用,这两种相互作用是没有文献报道过的,它们的生理学意义还有待进一步的实验发掘。通过插入突变实验,我们成功的在ZO1PDZ2的第22位缬氨酸之前插入了1-6氨基酸不等,其中当插入氨基酸达到3个或3个以上时,ZO1PDZ2会从同二聚体被突变成单体,分子量的确定是通过分子筛实验和沉降速率分析型超离心实验完成的。这种从二体到单体的突变成功为我们揭示出了ZO1PDZ2不同于经典PDZ结构域的单体构象而形成二体构象的原因。第22位缬氨酸刚好位于ZO1PDZ2按经典PDZ结构域定义的β2和β3之间,这里的残基较其他PDZ结构域少形成转角较难,所以β2同β3没有形成反平行的折叠片,而形成了一条连续的两倍长度的β链。ZO1PDZ2突变后的单体保留了同Cx43的相互作用,但相互作用强度大大减弱;同时该突变体不再能够同ZO2PDZ2以及ZO3PDZ2相互作用。找到了ZO1PDZ2形成二体的原因有利于我们进一步研究ZO1PDZ2在细胞内的功能。我们构建了全长ZO1的突变体,该突变体的PDZ2结构域被引入了如前所述的插入突变,因此ZO1突变体不再能够通过PDZ2二聚。MDCK细胞在紧密连接建立初期,其跨膜电阻(TER)曲线会经历依次迅速增高再回落,而ZO1缺失的细胞的TER曲线则一直较为平缓。我们将野生型ZO1及其突变体转染到内源ZO1被沉默的MDCK细胞中并们发现,野生型ZO1使得平缓TER曲线恢复了先迅速升高再降低的特点,而ZO1突变体没有这个能力。因此,我们认为ZO1蛋白中其PDZ2结构域的二聚对于紧密连接的建立是必须的。