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目的:本研究使用胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的C结构域多肽修饰壳聚糖(CS)制备生物活性CS-IGF-1C水凝胶,评价水凝胶的细胞相容性及其对脂肪来源干细胞(ADSCs)体外增殖、抗凋亡和促血管生成等生物学特性的影响。建立小鼠急性肾脏损伤(AKI)模型,利用水凝胶负载ADSCs移植入受损肾脏,评价CS-IGF-1C能否改善ADSCs在体内存活并提高其多向分化能力,探讨其增强细胞治疗效果的机制,为使用组织工程学手段促进肾脏修复提供新的理论依据。方法:1.从表达绿色荧光蛋白(GFP)-萤火虫荧光素酶(Fluc)双融合蛋白的转基因小鼠脂肪分离ADSCs进行体外培养,评价细胞增殖能力,使用荧光显微镜、流式细胞学(FCM)及生物发光成像(BLI)证实细胞转基因特性,鉴定细胞表型并描述其多向分化潜能。2.合成IGF-1的C结构域(IGF-1C)多肽,并使用多肽修饰CS获得CS-IGF-1C,使用傅里叶红外光谱(FT-IR)分析CS-IGF-1C的化学结构、平行板流变仪检测水凝胶的流变学特性、扫描电镜(SEM)观察CS-IGF-1材料的形态,并评价CS-IGF-1C的成胶性能。在涂布水凝胶的培养皿中培养ADSCs,观察细胞形态并使用活死染色评价水凝胶的细胞相容性。3.将ADSCs培养于涂布水凝胶的培养皿中,使用CCK-8法和BLI评价细胞增殖能力,实时定量RT-PCR技术检测细胞中增殖相关基因(HGF、IGF-1和EGF)的表达。对ADSCs进行H2O2刺激诱导氧化损伤,使用BLI和Annexin V/PI染色评价细胞凋亡,实时定量RT-PCR检测细胞中凋亡相关基因(Bax/Bad、Caspase-9/-3和Fas/Fasl)的表达。此外,利用实时定量RT-PCR检测ADSCs血管新生基因(Ang-1/-2、VEGF-A、HIF-1α、PLGF、PDGF-BB、b-FGF和CCL5)的表达。4.构建FVB小鼠急性肾脏缺血损伤模型,根据治疗情况分组:sham、PBS、CS、ADSCs、ADSCs/CS、ADSCs/CS-IGF-1C。利用BLI评价移植的ADSCs体内存活,高碘酸-希夫(PAS)染色及检测血清肌酐和尿素氮(BUN)的水平评价肾脏组织学和功能学恢复,损伤后14天使用GFP/Cytokeratin和GFP/CD31双染评价水凝胶对于ADSCs向肾小管上皮细胞和血管内皮细胞分化的影响。PCNA染色评价损伤后3天肾脏内细胞增殖及损伤后28天水凝胶注射部位和邻近区域细胞增殖情况。损伤后3天TUNEL和Bax染色评价肾脏内细胞凋亡。损伤后不同时间点CD31和α-SMA染色评价血管新生,损伤后14天CD31染色检测水凝胶注射部位毛细血管长入情况。对C57BL/6J背景VEGF-R2转基因小鼠诱导AKI,分组为sham、PBS、CS、ADSCs、ADSCs/CS、ADSCs/CS-IGF-1C,损伤后BLI实时检测VEGF-R2表达,探讨血管新生的机制。损伤后2个月Masson、天狼星红及IV型胶原染色评价胶原沉积,α-SMA染色评价肌成纤维细胞浸润,利用免疫染色评价肾脏中MMP-2的表达。使用实时定量RT-PCR检测肾脏组织中促纤维化基因(TGF-β、Col1A1和α-SMA)的表达。结果:1.体外培养的ADSCs具有较强的增殖能力并稳定表达GFP,体外BLI分析显示细胞数量和生物发光强度存在正相关(R2=0.99)。ADSCs表达间充质干细胞表面标记物(CD29、CD44、CD73、CD90、CD105),不表达造血系细胞标记物(CD31、CD34、CD45),且能被诱导向脂肪、骨和软骨细胞分化。2.FT-IR分析证实IGF-1C多肽成功连接到CS上,流变学检测显示CS和CS-IGF-1C两种水凝胶的成胶温度为35°C-36°C,SEM结果显示两种材料均具有均一的相互联通的多孔结构,孔径约为50μm-100μm。此外,水凝胶具有良好的细胞相容性。3.体外二维条件下培养ADSCs,CS-IGF-1C能促进细胞增殖并显著上调增殖相关基因的表达,能对抗H2O2诱导的细胞凋亡并下调凋亡相关基因的表达,还能上调ADSCs中血管新生相关基因的表达。4.体内研究中,CS-IGF-1C水凝胶能显著增加移植的ADSCs在肾内驻留,并且有利于ADSCs向肾小管上皮细胞及血管内皮细胞分化,从而促进肾脏组织学和功能学修复。CS-IGF-1C联合ADSCs移植能在损伤后早期,增强肾脏细胞增殖、抑制肾脏细胞凋亡,并增加肾脏血管新生。BLI分析显示,CS-IGF-1C/ADSCs组VEGF-R2的表达显著高于其他组。此外,ADSCs能够与水凝胶的微环境相互作用,CS-IGF-1C/ADSCs组水凝胶内血管长入和增殖细胞的数量显著高于其他组。损伤后2个月评价肾脏慢性纤维化,CS-IGF-1C/ADSCs治疗能显著减少肾脏间质内胶原沉积、肌成纤维细胞浸润以及MMP-2表达,并明显下调肾脏纤维化相关基因的表达。结论:1.我们开发出一种可注射的温度敏感性的生物模拟CS-IGF-1C水凝胶;2.CS-IGF-1C水凝胶具有较好的生物相容性,能在体外发挥促进ADSCs增殖、抑制凋亡、促进血管新生的作用;3.CS-IGF-1C水凝胶联合ADSCs注射到受损肾脏,可以改善ADSCs体内存活,增强细胞多向分化能力,加快肾脏修复;4.CS-IGF-1C水凝胶联合ADSCs治疗肾损伤的机制与两者相互作用所产生的增加肾脏细胞增殖、减少凋亡、促进肾脏血管新生及抑制肾脏纤维化等效应有关。