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第一章PRMT1调控急性髓细胞白血病铁死亡及作用机制背景和目的:急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia,AML）是起源于造血干/祖细胞的血液系统肿瘤。传统标准治疗虽能取得一定的疾病缓解率,但复发难治仍是目前亟待解决的难点与热点问题。深入探索AML发病机制,开发新靶点及新疗法对于提高AML缓解率及生存率具有重要意义。近年来,大量研究表明表观遗传异常在AML中具有重要作用,靶向表观调控因子在AML中具有广阔的应用前景。另一方面,研究提示铁死亡与白血病的发生发展相关。铁死亡是一种新型调节性细胞死亡形式,以铁依赖和脂质过氧化积累为特征,其与肿瘤等疾病的密切关联备受重视,诱导铁死亡可能是治疗AML的潜在方式。然而,在AML中铁死亡是否受到表观遗传的调控,以及铁死亡诱导剂与表观调控药物联合在AML中是否具有治疗价值尚不清楚。本研究探究了表观遗传因子对AML细胞铁死亡敏感性的调控及潜在的分子机制。材料和方法:本研究联合了细胞实验、数据库分析、动物实验及多组学分析等方法。细胞实验以代表性的AML细胞系（如NB4,HEL,MOLM-13）为主要实验对象;动物实验采用雌性裸鼠构建AML异种移植瘤模型。1.分别用细胞计数试剂盒-8（cell Counting Kit-8,CCK-8）法、Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞增殖活性和细胞死亡;2.通过BODIPY-C11（581/591）和Ferro Orange流式染色检测细胞脂质过氧化水平及Fe2+含量;3.通过公共数据库（TCGA,GTEx和Blood Spot）分析PRMT1在不同肿瘤中的表达情况,通过GEPIA 2数据库分析PRMT1及ACSL1的基因表达相关性;4.利用CRISPR/Cas9技术构建PRMT1、ACSL1、ACSL3和ACSL5基因敲除细胞,通过蛋白质免疫印迹检测敲除效率;5.通过异种移植瘤模型在体内检测GSK3368715联合RSL3的肿瘤抑制作用;6.采用纳米孔测序技术分析GSK3368715处理后铁死亡相关基因的表达差异;通过实时定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）和蛋白免疫印迹（western blot,WB）验证差异基因表达;7.利用染色质的靶向切割和标签化技术（Cleavage Under Targets and Tagmentation,CUT＆Tag）探究H4R3me2a和H3R17me2a修饰在全基因组及ACSL1启动子区域的分布情况。结果:表观抑制剂筛选结果提示,I型PRMTs抑制剂GSK3368715联合铁死亡诱导剂RSL3、FIN56可显著抑制多种AML细胞活性,其协同作用经Bliss独立模型确认。Annexin V-FITC/PI、BODIPY-C11（581/591）及Ferro Orange流式染色进一步证实GSK3368715联合铁死亡诱导剂可有效诱导AML细胞死亡,显著升高铁死亡关键指标水平,并可被铁死亡抑制剂Fer-1、Lip1和DFO所回复。在AML细胞中敲除PRMT1后观察到与GSK3368715类似的促铁死亡效应。表明GSK3368715主要通过靶向PRMT1,进而促进AML细胞的铁死亡敏感性。GSK3368715联合RSL3在AML异种移植瘤模型中可有效抑制皮下肿瘤生长,不伴明显体重下降。ONT-seq结果显示GSK3368715导致一系列铁死亡相关基因的表达发生改变,包括ACSL1、ACSL3、ACSL5、CYBB、POR、FTH1、PEX10和PEX12基因。q RT-PCR和WB进一步证实了GSK3368715处理前后ACSL1、ACSL3和ACSL5基因的差异表达。在AML细胞中敲除ACSL1、ACSL3和ACSL5基因,发现只有ACSL1敲除能够回复GSK3368715的促铁死亡效应。与此同时,PRMT1敲除能够显著升高AML细胞中的ACSL1蛋白水平,GEPIA 2数据库分析也提示PRMT1和ACSL1在AML和泛癌中均呈负相关。我们进一步通过CUT＆Tag技术探究GSK3368715处理后全基因组H4R3me2a（PRMT1介导）和H3R17me2a（CARM1/PRMT4介导）的变化。CUT＆Tag结果显示H4R3me2a和H3R17me2a主要富集在转录起始位点附近,GSK3368715可显著降低全基因组H4R3me2a丰度,对H3R17me2a无明显影响;此外,GSK3368715还导致ACSL1基因启动子区域H4R3me2a丰度显著降低。结论:PRMT1参与调控AML细胞铁死亡敏感性,抑制PRMT1可通过上调ACSL1表达进而促进AML细胞铁死亡,对表观修饰的探索发现GSK3368715导致ACSL1启动子区域H4R3me2a丰度降低。我们的研究对于深入理解PRMT1在AML发生发展中的作用有重要意义,同时提示联合表观因子抑制剂与铁死亡诱导剂在AML中具有潜在应用价值。第二章靶向BRD9和TAF1在急性髓细胞白血病中的作用及分子机制背景和目的:急性髓细胞白血病（AML）是造血系统最常见的恶性肿瘤之一,其特点是遗传和表观遗传突变导致白血病细胞分化阻滞和增殖失控。目前,AML患者接受强化化疗后的5年生存率仅为20%或更低,迫切需要开发有效的治疗新靶点或药物。许多表观遗传调控因子已被证实在AML的发生和发展中发挥重要作用。最近有多项研究表明溴结构域蛋白在AML发生发展中有重要作用。其中有文献报道,溴结构域蛋白9（BRD9）是AML发展所需的关键因子。而TATA框结合蛋白1（TAF1）在转录调控和白血病发生中发挥重要作用。然而,BRD9和TAF1作为AML治疗靶点的潜在效果尚不清楚。本研究探究了BRD9抑制剂I-BRD9和TAF1抑制剂Bay-299在AML细胞中的作用及其潜在的分子机制。材料和方法:利用TCGA数据库和UALCAN数据库分析TAF1在不同肿瘤中的表达。I-BRD9和Bay-299对细胞增殖的影响采用CCK-8进行检测。用流式细胞术检测细胞死亡、Ed U掺入和细胞分化。通过WB检测并证实凋亡通路的激活。采用q RT-PCR反应分析细胞周期和细胞死亡相关基因的表达。结果:公共数据库分析结果显示,TAF1在多种肿瘤中表达升高。I-BRD9和Bay-299显著抑制AML细胞的生长,伴有Edu掺入的减少和细胞死亡显著增加。除此之外,Bay-299还促进AML细胞分化。在机制上,I-BRD9诱导的细胞死亡可以被凋亡抑制剂Z-VAD回复,Fer-1也可一定程度地回复I-BRD9诱导的细胞死亡。此外,I-BRD9可以诱导包括PARP、Capase9和Capses3剪接体在内的凋亡标志物表达,而Z-VAD预处理可回复这些凋亡标志物的水平。此外,I-BRD9处理诱导AML细胞中IRE3、CDKN1A和CDKN2B的表达增加,这可能导致I-BRD9治疗后Edu掺入减少。总之,这些数据充分表明I-BRD9导致的AML细胞生长抑制依赖于细胞凋亡和细胞周期阻滞。对于Bay-299而言,凋亡抑制剂Z-VAD和受体相互作用蛋白激酶1（RIPK1）抑制剂Nec-2可以回复Bay-299诱导的细胞死亡。Bay-299处理增加了关键凋亡标志蛋白的剪接体水平,而Z-VAD和Nec-2可回复这一效应。此外,Bay-299处理增加了细胞周期抑制基因和多种促凋亡基因的表达,与在AML细胞中观察到的表型有关。结论:我们的结果提示,BRD9抑制剂I-BRD9和TAF1抑制剂Bay-299通过多种机制诱导AML细胞死亡,可能成为AML治疗中具有前景的候选药物。此外,我们的数据为BRD9和TAF1在AML细胞中的重要作用提供了支撑。