论文部分内容阅读
原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)是最早期的生殖细胞,它最终产生雄性和雌性生殖细胞。精子发生(Spermatogenesis)是雄性生殖一个复杂的细胞分化过程,它主要包括三个主要阶段,即精原细胞的有丝分裂,精母细胞的减数分裂,精子细胞经过变态转变为精子。由球形精子细胞变态产生精子的过程,称为精子形成。原始生殖细胞形成障碍会导致出生后生殖腺中生殖细胞的减少甚至缺失,精子发生障碍将导致少、弱、畸形精子症和无精子症。多种原因都会引起生殖细胞形成和精子发生障碍,而较为常见的原因之一是基因突变。据世界卫生组织(WHO)评估,不孕不育已经威胁到全球约15%的育龄夫妇,也就是每6~7对夫妇中有1对夫妇存在生殖障碍。我国近期调查结果显示国内不孕症患者约占已婚夫妇人数的10%,而且发病率呈上升趋势。其中男性不育患者已经占据人类不孕不育患者的一半左右。男性不育症的原因很多,主要原因包括生殖细胞形成异常和精子发生障碍等。基因突变会导致这两种问题的出现,进而导致精子功能缺陷从而引起雄性不育。虽然辅助生殖技术能帮助部分男性不育患者解决问题,但是对于基因突变导致的少、弱、畸形精子症,许多基因突变会随着亲代传递到下一代中,对下一代的生育力产生影响。而对于无精症患者,目前缺乏治疗的手段。因此,解决基因突变导致的不育症研究将会是一项具有挑战性的工作。我们利用Kitw/Kitwv不育症小鼠模型进行模拟,结合体细胞重编程、基因修复、胚胎干细胞向生殖细胞分化等一系列技术帮助无精症小鼠产生有功能的配子及健康后代。一.构建具有多能性的Kitw/Kitwv nt ESCs利用体细胞核移植技术将Kitw/Kitwv雄性不育小鼠尾尖成纤维细胞(Tail tip fibroblasts,TTFs)重编程为Kitw/Kitwv核移植胚胎干细胞(Nuclear transfer embryonic stem cells,nt ESCs),经四倍体小鼠验证nt ESCs具有多能性。二.应用TALENs技术修复W突变位点通过共转转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases,TALENs)表达载体和打靶载体对nt ESCs进行针对W位点突变的基因修复,通过新霉素(Neomycin analog,G418)和更昔洛韦(Ganciclovir,GANC)两种抗性的药物筛选,利用piggy Bac转座子载体进行暗盒切除得到修复后的nt ESCs。TALENs基因修复技术不会在细胞基因组中残留多余的外源基因,不会影响细胞基因组完整性,并且操作方便,效率高,特异性强。三.nt ESCs诱导成PGCLCs对修复后nt ESCs进行生殖细胞即原始生殖细胞类似细胞(primordial germ cell-like cells,PGCLCs)分化,利用SSEA1(Stage-specific embryonic antigen1)和整合素β3(Integrinβ3)两种原始生殖细胞的特异性标记物进行纯化分选。未修复的nt ESCs无法通过体外分化得到PGCLCs,只有修复后的细胞才能够通过流式分选获得双阳性的PGCLCs。四.PGCLCs睾丸内移植直接将PGCLCs移植入唯支持细胞综合征(Sertoli cell-only syndrome)的Kitw/Kitwv小鼠睾丸中。此外,为了能够利用白消安造模小鼠睾丸作为受体,修复后的nt ESCs引入了一个红色荧光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)作为示踪;或修复后细胞来源的PGCLCs与增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记的睾丸体细胞共移植。三种移植小鼠两个月后分离移植的睾丸进行切片分析,结果显示这三种移植方法都能够建立完整的生精上皮,完成精子发生。五.单倍体细胞通过ICSI和胚胎移植获得子代将曲细精管的分离消化后,通过流式分选得到单倍体细胞,进行卵胞浆单精子注射(Intracytoplasmic sperm injection,ICSI),将注射后胚胎移植到假孕母鼠子宫中得到了存活并可育的小鼠。综上所述,我们结合体细胞重编程技术,基因修复技术以及ESCs的体外分化技术对TTFs进行操作,成功的将成体细胞转变为PGCLCs,并且进一步利用体内的微环境得到了可以产生健康子代的精子。本研究为临床治疗由基因突变导致的男性不育症开拓了新的技术方法。