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水稻种子在胚乳中积累大量的储藏蛋白，约占籽粒干重的6-10％，其中谷蛋白占80％左右，贮存于PBⅡ中，任何对谷蛋白含量和组成的改变都会引起稻米品质的变化。虽然几乎所有的谷蛋白基因已经得到克隆，但人们对谷蛋白的表达调控及谷蛋白的合成、转运和沉积等过程尚缺乏足够的了解。利用突变体结合图位克隆技术是解决上述问题的捷径。我们通过对9000多份资源的筛选获得了17份谷蛋白突变体，对其中的低谷蛋白突变体W3660进行了精细定位，并将紧密连锁的分子标记应用于辅助选择育种；图位克隆了谷蛋白前体剧增突变体W379的突变基因，并对其突变的机理进行了深入的探讨；图位克隆了谷蛋白前体部分增加突变体Q4041的突变基因，并对该突变体进行了基因芯片的研究。研究结果如下：1谷蛋白突变体的筛选利用SDS-PAGE技术从地方品种、T-DNA插入系和辐射诱变突变体中筛选获得了17份突变体材料，突变频率仅0.189％，分为3种类型：低谷蛋白突变体，共8份，其特点是谷蛋白成熟的酸性和碱性亚基大量减少，球蛋白和醇溶蛋白含量大量增加。该类型的突变体可以用作培育适合肾脏病人和糖尿病人食用的低谷蛋白水稻品种，同时还可以用来分离谷蛋白表达调控相关基因；谷蛋白前体增加突变体（57H），共7份，表现为谷蛋白57kD前体不同程度的增加，酸性和碱性亚基相应减少，该突变体可以用来克隆谷蛋白转运、沉积途径中的关键基因；球蛋白缺失体，共2份，该类型突变体有可能是球蛋白基因的突变，亦可能是其关键的调控基因的突变，同时聚合球蛋白缺失性状和低谷蛋白性状将有助于培育可溶性蛋白含量更低的水稻品种。2 W3660突变基因的精细定位与分子标记辅助选择利用粳稻品种W3660与籼稻品种惊人糯杂交构建的F2群体及其衍生群体对控制W3660低谷蛋白性状的基因进行了研究，结果显示：突变性状受显性单基因控制。采用SSR标记技术，将该基因定位于第2染色体标记SSR2-001／SSR2-004和RM1358之间，距SSR2-001／SSR2-004和RMl358的遗传距离分别为1.1cM和3.8cM。虽然W3660的突变基因与Lgc-1位于同一个定位区间，但二者是不同的突变体。我们分析了与目的基因紧密连锁的分子标记在W3660与7个粳稻品种之间的多态性，将存在多态的SSR2-004和RM1358用于分子标记辅助选择，并计算获得两个标记在粳／粳交组合中辅助选择的效率分别为96.8％和92.7％，而采用双标记进行选择的效率则高达99.8％，从而为突变基因的分子标记辅助育种奠定了基础。3 W379突变基因的克隆及其功能研究利用W379／培矮64∥W379 BC1F1群体和W379／培矮64 F2群体，判定W379谷蛋前体剧增性状受一对隐性核基因的控制，并将突变基因精细定位于第4染色体标记RM4-001和IN4-001间，两侧标记同位于BAC克隆OSJNBa0091D06中，中间的物理距离约30kb，利用生物信息学的方法，发现该区域存在一个液泡加工酶基因，并命名为osVpel，采用RT-PCR的方法获得了该基因的编码区，序列比对后发现，突变体和野生型间只有一个核苷酸的差异，导致了W379中osVPE1蛋白的269位由Cys突变为Gly。酶活性测定显示，W379发育胚乳中Asn特异剪切活性不到日本晴中的10％，功能互补试验证实了osVpel就是目的基因。半定量RT-PCR分析表明，osVpel的表达模式和表达水平在日本晴和W379间无显著差异，亚细胞定位结果显示突变的蛋白亦分选进入液泡中。体外表达并纯化了osVPE1片段，制备了多克隆抗体，采用粗酶提取液提取蛋白进行的Western杂交显示，W379胚乳中的osVPE1（C269G）大都以前体的形式存在，而日本晴胚乳中则存在成熟的蛋白形式；而采用总蛋白提取液提取蛋白进行的Western杂交显示，W379中的VPE成熟蛋白分子量小于日本晴中的正常蛋白，暗示osVPE1（C269G）成熟时的剪切发生了错误，导致其功能的丧失。同时，突变体和野生型中的蛋白在体外温浴时，野生型蛋白能够进行正确的自我剪切成熟，而突变体只能够进行剪切形成中间形式的蛋白，不能形成成熟的蛋白。4 Q4041突变基因的克隆及功能研究我们从N22辐射诱变突变体库中筛选获得了一谷蛋白前体部分增加的突变体Q4041，该突变体还表现为成熟酸性和碱性亚基的部分减少，脂肪含量、游离氨基酸含量和赖氨酸含量大大增加，直链淀粉含量下降，种子变小，胚乳不透明等。对成熟胚乳自然断面的扫描电镜观察显示，Q4041中淀粉粒形状不规则，且排列疏松。突变体和野生型正反交试验表明突变性状受单个隐性核基因控制。利用Q4041／热研2号F2群体将目的基因定位于第12染色体末端BAC克隆OJ1584D02中27kb的区域，利用生物信息学方法预测到该区域存在一个Rab5a基因，我们将它命名为osRab5a。基因组和cDNA序列分析表明osrab5a在第3个外元缺失了13bp，造成移码突变，蛋白翻译提前终止。我们构建了一系列的转基因载体对该基因进行功能互补研究、亚细胞定位、体外表达研究等。同时我们对Q4041和N22发育胚乳RNA进行了基因芯片的研究，发现了一大批表达发生显著变化的基因（Foldchange＞2或Foldchange＜0.5为界），包括1个表达下调的基因（osRab5a）和1000多个表达上调的基因，表达上调的基因中包括糖代谢和淀粉合成相关基因，Ca2+结合相关基因（calmodulin，EF-hand protein），过氧化物酶基因，真核生物转录因子等，为全面阐述osRab5a的功能奠定了基础。