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杨树是重要的速生用材树种之一,采用基因工程育种技术开展杨树遗传转化的研究,是加速培育出优质、高抗杨树新品种的有效途径。
本研究以小黑杨花粉植株作为材料,开展了小黑杨花粉植株转betA的研究。探讨了抗生素对农杆菌的抑制效果和对植物叶片不定芽产生率的影响,确定了选择抗生素和除菌抗生素的种类及适宜浓度。建立了农杆菌介导法小黑杨花粉植株高效遗传转化系统:即以小黑杨花粉植株无菌叶片为外植体,预培养3d,在农杆菌菌液浓度OD600为0.2中浸染15min,将其置于分化培养基上共培养4d,再转置于含50mg/L卡那霉素和500mg/L头孢唑林钠的脱菌分化培养基上脱菌选择培养。
利用此转化系统,先后共获得了22株具有卡那霉素抗性的小黑杨,分别用特异引物对其进行PCR检测,22株均为转betA基因阳性植株,进而对22株转betA基因小黑杨进行了Southern斑点检测,均为阳性,选择10株转betA小黑杨进行Southern印迹杂交检测,阳性株系有4株,占40%。
从转入betA基因小黑杨株系中选择繁殖数量大,生长正常的9个株系及非转基因对照进行盐胁迫处理,分析转基因株系和对照株系的甜菜碱含量、盐害情况和生长量,结果表明:9个转基因株系及对照的甜菜碱含量差异显著,9个转基因株系的甜菜碱含量均比对照高,且均达到了极显著差异。9个转基因株系的盐害指数均比对照低,而耐盐性较对照高。9个转基因株系的甜菜碱的平均含量超过非转基因株系的27.1%。甜菜碱含量最高的T3超过非转基因株系的39.1%,最低的T1甜菜碱含量也超过非转基因株系的19.6%。根据转基因株系、对照的盐害程度及苗木高生长综合分析,初步选择出耐盐性强、生长量大的转基因株系为T4、T6、T5、T1。
转基因株系之间的甜菜碱含量及耐盐性不同,个别的转基因株系之间的甜菜碱含量在5%的显著性水平下,差异达到显著性水平,这种差异也为进一步选择提供了基础。