研究背景与目的全球慢性乙型肝炎(hepatitis B virus, HBV)感染人数约3.6亿,每年因HBV感染所致相关肝病死亡的患者达100万人,其感染可引起一系列肝脏疾病,包括慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)、肝硬化(Liver Cirrhosis, LC)和肝细胞癌(Hepatic cell carcinoma, HCC)等。HBV感染已成为影响我国人民健康的较为严重的公共卫生问题。核苷类药物(nucleos(t)ide analogues, NAs)是目前治疗CHB的常用药物之一。由于NAs在治疗CHB患者过程中,其应答率较高,每日仅需口服一次且副作用小,因此在临床上被广泛使用。但又因其治疗CHB疗程的长期性与不确定性,临床上患者自行停药、不规范停药的现象较为常见。CHB患者的不规范停药与自行停药会引起一系列不良的严重后果,包括病毒反弹、促进耐药与病情的进一步进展,造成后续治疗困难。NAs抗HBV治疗停药后的持久应答是我们期望的满意治疗终点。所谓持久应答,是指停药后至少一年,仍能保持治疗结束时的完全应答,即血清转氨酶复常、血清HBV DNA阴性且维持HBeAg血清学转换。近年来有不少回顾性研究预测停药后持久应答,但主要集中在临床指标的分析上,包括患者年龄、血清HBsAg水平、HBeAg血清转换时HBV DNA水平、cccDNA水平、乙型肝炎病毒核心抗原相关抗原(HBcrAg)水平、口服NAs患者获得应答的时间和NAs巩固治疗时间等,较为一致的结论是：患者年龄越小、停药时血清HBsAg水平越低、HBeAg血清转换时HBV DNA水平越低、肝组织中cccDNA水平越低、血清HBcrAg水平越低、NAs治疗中获得完全应答时问越短、取得完全应答后NAs巩固治疗时间越长,停药后复发的机会越少。然而,隐藏在这些临床常规指标后面的免疫学参数、以及其免疫控制持久应答的机制,尚待深入研究。白细胞介素-21(IL-21)是一种主要由活化的CD4+T细胞、NKT细胞和Th17细胞产生的多功能细胞因子。IL-21与IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15一样拥有相同的细胞因子受体γ链即γc。它的多效性表现在：调控免疫球蛋白的生成,引导终末期B细胞分化成浆细胞,协同地扩展CD8+T细胞的增殖,引导Th17的分化,对树突状细胞的抗原提呈有抑制作用,可以促进B细胞和NK细胞凋亡。此外,IL-21具有抗肿瘤效应的可能,与病毒感染性疾病的发展相关。因此在体内调控IL-21的活动对于一部分疾病具有临床应用的潜力。在过去的几年中,IL-21的作用逐渐变得明确,它不仅调控正常的淋巴细胞的发育和功能,而且在炎症反应、过敏反应以及感染性疾病中起到重要的作用,同时亦有研究表明其有抗肿瘤的活性。目前IL-21是一个研究热点。近年研究发现,在慢性病毒感染过程中,IL-21能够促进CD8+T细胞的增殖并增强CD8+T细胞应答,在CD4+T细胞辅助CD8+T细胞控制病毒感染慢性化中起到重要作用。而关于IL-21是否在核苷类药物停药后持久应答起到重要作用,以及通过何种机制保持停药后的持久应答有待阐明。本研究通过随访并检测经NAs治疗停药后的CHB患者血清病毒学及生化学指标,探讨预测停药后持久应答的临床指标；通过检测停药患者血清IL-21的水平,探讨IL-21与停药后持久应答的相关性；通过检测停药患者机体HBV-特异性CD8+T细胞功能,分析血清IL-21水平与CD8+T细胞应答的关系,探讨停药患者维持持久应答的可能机制,为拓展IL-21和相关免疫细胞在慢性HBV感染者中的临床应用提供科学依据。研究方法1.停药后临床指标的检测对于治疗前HBeAg阳性停药患者,持续口服NAs治疗至HBV DNA在检测线以下、谷丙转氨酶(ALT)复常、HBeAg发生血清转换后再继续巩固治疗至少12个月；对于治疗前HBeAg阴性患者,治疗至HBV DNA在检测线以下、ALT复常后再继续巩固治疗至少18个月。所有病例均排除甲、丙、丁、戊型肝炎及其他病毒感染及自身免疫性肝病、肝硬化、肝细胞癌等。筛选合格患者按停药标准停药,停药后纳入我们的密切跟踪随访系统。所有受试者各随访点采清晨空腹静脉血30ml：其中抗凝血20ml,采用密度梯度离心法分离外周血单个核淋巴细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),-80℃保存；促凝血10ml,离心后取上清置PC管中-20℃保存,同批检测。本项研究已经在世界卫生组织国际临床试验注册平台注册(注册号：ChiCTR-ONRC-12002315)。经南方医科大学南方医院伦理委员会审批,本临床研究已经通过并批准进行(NFEC-201209-K3)。本研究每位入选患者都给予充分知情同意并书面签署知情同意书。临床指标的实验室检测：生化学检测：采用Olympus AU5400全自动生化分析仪。病毒学检测：HBV DNA定量检测采用Combas荧光定量PCR法分析,采用微粒子化学发光法检测HBV血清标志物(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb)。2.血清IL-21水平的检测采用双抗体夹心ELISA (eBioscience, San Jose, CA, USA)方法检测受试者血清IL-21水平。严格按照试剂盒说明书进行,取受试者血清及标准品各100ul加入酶标板,其中标准品做倍比稀释。终止反应后,采用酶标仪(FACSCalibur, BD, USA)测定吸光度(OD)值,以OD值计算IL-21水平。3.HBV-特异性T细胞应答的检测复苏冻存的PBMC,分为HBV核心肽库刺激孔与再刺激孔进行铺板,第四天加入IL-2,刺激十天后,采用细胞内细胞因子染色(Intracellular cytokine staining, ICS)检测,检测前加入蛋白转运抑制剂(Brefeldin A, BFA)孵育5小时。表面标记抗体：7AAD-Percp, anti-CD3-FITC, anti-CD8-APC,胞内标记抗体：anti-IFN-γ-PE,洗涤后加300ul 2%多聚甲醛固定,上机检测。结果计算：以再刺激孔IFN-γ+CD8+T细胞频数减去未再刺激孔IFN-γ+CD8+T细胞频数大于0为HBV-特异性CD8+T细胞阳性。结果1.CHB患者经NAs治疗停药后临床指标对持久应答的预测作用60例符合停药标准的CHB患者停药,经51.3±1.9(48-56)周的随访,病毒学复发患者24例(40%),其中临床复发13例(21.6%)(6例复发点为停药后第12周；7例复发点为停药后第24周),对于临床复发患者再次予核苷类药物抗病毒治疗,同时本停药研究的随访结束,纳入普通随访；持续应答患者36例。持续应答组患者在停药基线年龄及HBsAg滴度显著低于病毒学复发组(p=0.03,p=0.001),但在性别比例、治疗前HBeAg状态、总治疗时间、应答时间以及巩固治疗时间上均无显著差异。2.停药患者血清IL-21水平的动态变化60例CHB患者停药基线、停药后第12周、第24周、第48周血清IL-21水平依次为40.90pg/ml(24.50-182.44pg/ml)、42.71pg/ml(24.50-156.16.17pg/ml)、 42.68pg/ml(25.92-215.48pg/ml)、42.90pg/ml(27.35-200.85pg/ml),停药后第12周、第24周、第48周与停药基线相比均无显著性差异；病毒学复发组停药基线、停药后第12周、第24周、第48周血清IL-21水平依次为42.68pg/ml (25.92-182.44pg/ml)、41.48pg/ml(24.50-150.16pg/ml)、45.68pg/ml(28.77-215.48 pg/ml)、42.64pg/ml (27.35-200.85pg/ml),其中停药后第12周、第24周、第48周与停药基线相比均无显著性差异。持续应答组停药基线、停药后第12周、第24周,第48周血清IL-21水平依次为39.59pg/ml (24.50-117.16pg/ml)、 42.71pg/ml (25.92-114.53pg/ml)、40.84pg/ml (25.92-118.48pg/ml)、43.52pg/ml (28.77-128.65pg/ml),其中停药后第12周、第24周、第48周显著高于停药基线(分别p=0.0035,p=0.0124,p=0.0002)。3.血清IL-21水平与血清HBsAg滴度及HBV DNA水平的关系病毒学复发组血清HBV DNA水平随着随访时间延长呈持续上升趋势,血清HBsAg滴度无明显变化,血清IL-21水平亦无明显变化。而在持续应答组血清HBV DNA水平随着随访时间延长,呈持续稳定低水平,血清HBsAg滴度亦无明显变化,但血清IL-21水平在随访过程中呈稳定高水平状态。60例停药患者总血清IL-21水平与血清HBsAg滴度及HBV DNA水平间均无显著相关性；病毒学复发组及持续应答组血清IL-21水平与血清HBV DNA水平无显著相关性；病毒学复发组血清IL-21水平与血清HBsAg滴度呈正相关(r=0.290,p=0.01),持续应答组血清IL-21水平与血清HBsAg滴度呈负相关(r=-0.328,p<0.0001)。4.HBV-特异性T细胞应答我们对20例HLA-A2阳性患者停药基线HBV-特异性T细胞应答进行检测,HBV-特异性T细胞应答检出率为30%(6/20),而IFN-γ+CD8+T细胞百分比为0.133%±0.062%(0.054%-0.228%),HBV-特异性T细胞应答在病毒学复发组与持续应答组患者分别检出2例(2/11)和4例(4/9),两组间检出率无统计学差异。结论：停药基线时患者年龄及HBsAg滴度可作为较好的持续应答预测指标；持续应答患者停药后血清IL-21呈高表达状态；停药后血清IL-21水平在病毒学复发组和持续应答组分别与患者血清HBsAg水平呈正相关和负相关,这提示IL-21可能作为一种炎症因子及免疫调节因子在CHB患者停药后免疫控制中起到一定的作用。