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猴泡沫病毒(Simian Foamy Virus,SFV)属于反转录病毒科,泡沫反转录病毒亚科,是一种类似于猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus,SIV)的反转录病毒。SFV虽然不会对灵长类动物致病,但在物种间的传播会引起致病性的改变,猴作为一种重要的模式动物,应用于多种疾病模型,也用于相关生物制品的生产,因此,进一步完善对实验猴群的质量监控迫在眉睫。在实验动物病毒检测等级标准中,猴泡沫病毒是清洁级实验动物应排除的病原体。目前,多用全病毒包被ELISA法及PCR法检测SFV感染状况。现有检测方法的检测范围有限,程序较为复杂。 本课题尝试从两个方面建立 SFV的检测方法,一是从分子生物学方面,建立SFV核酸的PCR检测方法及荧光定量PCR方法;二是从血清学方面,合成重组蛋白代替SFV抗原来检测血清中的SFV抗体,并建立猴泡沫病毒的间接免疫荧光检测法。同时,将所建立的检测方法应用于实验用猴及相关生物制品的检测,以验证其开展实际应用的价值。 根据NCBI上发表的SFV-1的基因组序列,将其与小鼠白血病病毒(MuLV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)等反转录病毒科病毒的基因组进行比对,找出差异序列,设计引物。筛选到四组引物,其中PCR引物一组,RT-nestPCR引物三组。为验证引物的特异性,设立了小鼠白血病病毒(MuLV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、麻疹腮腺炎病毒和正常BHK-21细胞等多个对照。只有SFV有特定大小的目的条带出现,特异性较好。对四组引物进行灵敏度比较,有一组RT-nestPCR引物灵敏度最高,可检测到的最小病毒滴度为106.3TCID50,可检测到的最小核酸浓度为0.26pg/μL。 以定量的10倍系列稀释的质粒pGEM-T Easy-SFVpol为标准品进行荧光定量PCR扩增,建立了检测SFV的荧光定量PCR方法。用建立的检测方法对猴外周血淋巴细胞及脊髓灰质炎疫苗进行检测,并与常规 PCR检测方法作比较。结果显示,所建立的方法灵敏度可达4705拷贝/μL,比常规PCR检测方法灵敏度高100倍,而与小鼠白血病病毒(MuLV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)没有交叉反应,具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点,适合于对猴群及相关生物制品的SFV进行批量检测。 用大肠杆菌BL21(DE3)表达了gag蛋白C末端的193个氨基酸,该区域为免疫优势表位,有较强的诊断潜能。对表达的蛋白进行纯化,并用蛋白印迹法检验其抗原性,与SFV抗体阳性的小鼠血清及猴血清有明显反应,与MuLV抗体阳性的小鼠血清无明显反应,说明所表达抗原特异性良好。用方阵滴定法确定抗原的最适工作条件为:包被抗原浓度5μg/ml,BHK-21细胞正抗稀释度1:20000,血清稀释度1:80,羊抗人二抗稀释度1:30000。评价猴泡沫病毒重组抗原ELISA检测方法的精密度及重复性,并应用于实验用猴的检测。 为检测实验用猴群中 SFV的感染情况,建立了针对猴血清的间接免疫荧光方法(IFA)。用SFV病毒BHK-21细胞培养的方法制备抗原,通过浓度梯度滴定,分别确定了一抗猴血清的最佳工作浓度为1:10,二抗FITC标记的羊抗人IgG抗体的最佳工作浓度为1:100。根据荧光强度可以对猴血清抗体水平进行半定量分析。 所建立的PCR方法可以作为SFV感染的确证方法,荧光定量PCR技术检测SFV国内外尚未见报道,该方法准确性好,检测效率高,可用于猴泡沫病毒的定量检测,为评价实验动物猴泡沫病毒的感染状况提供了依据。在国内首次建立了猴泡沫病毒的重组抗原ELISA检测方法,为SFV检测标准的制定提供了技术条件。结合免疫荧光检测方法,有利于确定猴群中感染SFV的真实水平。