论文部分内容阅读
第一章DICAR-Tg小鼠抵抗DCM的发生与发展目的评价DICAR过表达能抑制糖尿病心肌病的发生与发展。方法用构建DICAR-Tg模型小鼠,并分别在野生型（WT）和DICAR-Tg小鼠模型上通过高脂饮食和尾静脉注射四氧嘧啶,建立糖尿病模型。在模型建立后分别在1-6月,采用多普勒超声评价心功能。采用麦胚凝集素（wheat germ agglutnin,WGA）染色评价心肌重构,采用Masson三色染色法（masson-trichrome staining,Masson）染色法,计算心肌胶原容积分数（collagen volume fraction,CVF）来观察心肌胶原沉积。采用免疫组织化学染色观察III型胶原蛋白（collagen type III,col-III）的表达来评价心肌纤维化程度。为了探讨细胞焦亡在DICAR+/-和DICAR-Tg+T2DM小鼠的心脏组织中的发生,采用western blot检测技术检测GSDMD、NLRP3、IL-1β等焦亡相关指标的表达变化。结果超声心动图显示,前5月的各项指标无统计学差异但有心功能减弱的趋势。在第6个月时,与WT组相比,WT+T2DM组小鼠心腔变大,左心室舒张末期内径（Left ventricular internal diastolic diameter,LVID.d）增大至4.14±0.12 mm,左心室收缩末期内径（Left ventricular internal systolic diameter,LVID.s）增大至3.14±0.10 mm;WT+T2DM组小鼠左心室舒张末期容积（Left ventricular end diastolic volume,LVEDv）增大至73.40±5.60,左心室收缩末期容积（Left ventricular end systolic volume,LVESv）增大至33.38±5.36,而左心室射血分数（Ejection Fraction,EF）降低至48.42±3.65%,左心室短轴缩短率（Fractional Shortening,FS）下降至24.27±2.26%。多普勒超声心动图检测结果提示,相较于WT组,WT+T2DM小鼠心脏结构出现异常,心脏收缩和舒张功能发生障碍。相比于WT+T2DM组,DICAR-Tg+T2DM组小鼠中,以上指标均发生了明显地改善,即DICRA过表达后使得小鼠的心腔有所缩小,EF和FS有所增强。WGA染色结果显示,WT+T2DM组与WT组相比,其心肌细胞明显肥大,而DICAR-Tg+T2DM组相较于WT+T2DM组有明显改善。Masson染色结果显示,相较于空白对照组WT,WT+T2DM组中小鼠心肌切片上心肌纤维化严重,而DICAR-Tg+T2DM组对此现象有明显改善。免疫组织化学染色结果显示,WT+T2DM组与WT组相比,col-III表达增加,而DICAR-Tg+T2DM组对此现象有明显改善。Western blot结果显示,DICAR+/-小鼠中焦亡相关蛋白均上调且3月龄的上调更明显,DICAR-Tg+T2DM小鼠与WT+T2DM相比,焦亡受到抑制。结论DICAR的过表达改善了糖尿病小鼠的心脏功能障碍和重塑,并逆转了小鼠心肌细胞中的焦亡,DICAR可能是治疗DCM的靶基因。第二章寡核苷酸DICAR-JD抵抗DCM作用及机制研究目的观察DICAR-JD对T2DM诱导的心功能损伤的影响,探讨其可能的分子机制。方法在RNAfold中识别DICAR的二级结构。采用Ch IRP质谱（Chromatin Isolation by RNA Purification-mass,Ch IRP-MS）鉴定与DICAR相互作用的结合蛋白。在WT小鼠和db/db（type 2 diabetes mellitus）小鼠心脏组织中用western blot检测总含有valosin的蛋白质（valosin-containing protein,VCP）的表达,用RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay,RIP）测定VCP蛋白并通过western blot评估IP的特异性。采用表面等离子体共振（surface plasmon resonance,SPR）分析测量DICAR和VCP之间的动力学速率常数。培养小鼠心肌细胞,m DICAR-JD和VCP-si RNA共转后,糖基化终末产物（advanced glycationend products,AGEs）（200μg/ml）处理48 h,用western blot检测技术细胞焦亡相关指标的表达变化。在DICAR+/-和DICARTg小鼠心肌组织western blot检测内质网的VCP蛋白的表达。使用液相色谱仪-质谱仪（liquid chromatograph-mass Spectrometer,LC-MASS）检测WT和DICAR+/-之间心脏组织的蛋白质表达水平,在DICAR+/-小鼠和db/db小鼠心脏组织中用western blot检测了这五种蛋白质。结果结构域显示DICAR有一个特定的茎环结构,因此合成寡核酸片段DICARJD。Ch IRP-MS鉴定VCP为与DICAR结合分数最高的蛋白质。Western blot结果显示,心脏组织中总VCP蛋白的表达在WT小鼠和db/db小鼠之间没有差异;在VCP IP中检测到独特的VCP条带,但在Ig G IP中没有检测到VCP。SPR结果显示,VCP蛋白与DICAR的亲和力为5.49 x 10-7,两者具有亲和力较好。Western blot结果显示,m DICAR-JD抑制了AGEs诱导的细胞焦亡,并且VCP-si RNA又增强了DICAR-JD抗焦亡的作用。Western blot结果显示,与WT组相比,DICAR+/-促进ER中VCP的表达,DICAR-Tg抑制位于ER中的VCP。LC-MASS显示泛素化中有5个蛋白的表达下调,包括Myom1、Myh6、Med12、Myl2和Cavin2;与WT小鼠相比,Med12蛋白在3月龄的DICAR+/-和db/db小鼠中的这5种蛋白质中显著下调。结论DICAR/VCP调节Med12降解过程并介导糖尿病诱导的心肌病的细胞焦亡。