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自然界的植物经常会遭受干旱、盐碱和低温等恶劣环境的胁迫危害,使植物缺水受到伤害,生长发育受到抑制,给作物生产带来严重的质量和产量的下降。这些非生物胁迫造成的危害已经成为农业增产、生态环境改良、实现可持续发展的重要限制因素。因此,阐明植物对环境胁迫信号的应答机制,应用基因工程手段提高植物的抗逆性,已成为未来农业发展的关键和基础性工作。CBF通过与CRT/DRE(C-repeat/dehydrationresponsiveelement)顺式作用元件的结合激活低温和脱水响应基因的表达,提高植物的抗逆性。因此,CBF类转录因子能够综合改良植物的抗逆性状,是迄今为止较为理想的抗逆工程基因之一。
本研究首次利用PCR和chromosomewalking的方法从小拟南芥中得到ApCBF基因的全长,并已将该序列提交Genebank,登录号为:DQ207404。
本研究选用了CaMV35S组成型启动子和人工合成的由水杨酸诱导的启动子SAR、拟南芥CBFs家族中的CBF1和CBF3、新疆小拟南芥COR15a基因及其CRT/DRE顺式作用元件构建了不同组合的六个植物表达载体:pCB111、pCB111-1、pCB112、pCB112-1、pCB113和pCB113-1,并采用农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草,获得了大量的抗性植株。对抗性植株进行PCR分析,结果为44-88%抗性植株呈阳性。选取其中7株表型明显、生长良好PCR检测为阳性的转基因烟草植株进行southern-blot分析,结果表明所有待检样品均出现较强的特异杂交信号,说明目的基因已经整合到转基因烟草植株的基因组中。对southem-blot检测为阳性的转基因植株,提取RNA进行半定量RT-PCR分析,结果发现CBF1基因在大部分转基因植株中得到了转录水平的表达。
本研究不仅为进一步研究CBF1、CBF3、ApCOR15a以及人工合成的由水杨酸诱导的启动子SAR的功能奠定了理论基础。而且为研究和开发利用通过向植物中导入抗寒基因来提高植物的抗寒性提供了一条新途径,具有一定的理论意义和应用前景。