论文部分内容阅读
脾脏免疫细胞,尤其是巨噬细胞(Macrophages,Mφ),在肝纤维化中发挥了重要的作用。已经有研究表明中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子(Mesencephalicastrocyte-derived neurotrophic factor,MANF)在视网膜中的免疫调控作用,然而MANF是如何影响肝纤维化的脾脏免疫细胞目前仍不清楚。在本研究中,我们在野生型(Wild type,WT)小鼠和单核巨噬细胞特异性敲除MANF(Mono-macrophage-specific MANF knockout,Mφ MANF-/-)小鼠,用四氯化碳(CarbonTetrachloride,CCL4)构建了肝纤维化模型,在该模型上观察了脾脏中巨噬细胞的变化。结果发现,与WT小鼠比较,MφMANF-/-可引起小鼠脾脏中M1型巨噬细胞增多。而在肝纤维化时,与WT小鼠比较,MφMANF--可引起小鼠脾脏中M2型巨噬细胞和浆细胞增多。无论是在正常还是肝纤维化情况下,MANF对于T细胞和B细胞的数量都没有影响。我们的研究结果表明,MANF对不同类型免疫细胞的调控具有差异性,并且MANF可以特异性的调控脾脏巨噬细胞的分化,这对于影响肝纤维化的进程具有重要作用。目的研究MANF对于脾脏中的免疫细胞是否具有调控作用。方法WT和Mφ MANF-/-小鼠腹腔注射CCL4,2 μl/g,持续8周。所有小鼠在第9周处死,将脾脏取出称重,计算脾脏重量与体重的比值。脾脏组织一部分包埋,另一部分冷冻在液氮中用来检测细胞因子。用HE染色观察脾脏结构,用免疫组织化学检测不同类型的免疫细胞,用荧光定量PCR检测不同的细胞因子。结果1.小鼠肝纤维化模型构建成功HE染色和天狼星红染色证明小鼠肝纤维化模型构建成功。2.小鼠巨噬细胞中MANF敲除的鉴定从MφMANF-/-小鼠的腹腔中提取巨噬细胞,培养24 h之后,运用细胞免疫荧光和Western blot检测Mφ MANF-/-小鼠巨噬细胞是否成功敲除MANF。结果表明,在Mφ MANF-"-小鼠巨噬细胞已经成功敲除MANF。3.正常情况下,单核-巨噬细胞中MANF敲除不会影响脾脏的结构和尺寸HE染色结果显示,与WT小鼠相比,MφMANF-/-小鼠的脾脏未出现明显肿大,两组小鼠脾重/体重无差异,淋巴小结数量和红髓区面积也未出现明显差异。4.正常情况下,单核-巨噬细胞中MANF敲除会增加脾脏中M1型巨噬细胞的数量采用免疫组化方法检测脾脏免疫细胞的类型及数量变化,结果发现在正常情况下,小鼠巨噬细胞中MANF敲除会显著增加M1型巨噬细胞的数量,对浆细胞、T细胞和B细胞的数量没有明显影响。5.在肝纤维化情况下单核-巨噬细胞中MANF敲除会导致更为明显的脾肿大HE染色结果表明,与WT小鼠比较,MφMANF-/-小鼠的脾脏出现了更为明显的肿大。MφMANF-/-鼠的脾重/体重升高,红髓区面积增加,而淋巴小结数量不变。同时发现,肝纤维化状态下MφMANF-"-小鼠的脾脏中的巨噬细胞和浆细胞增多。6.肝纤维化情况下,小鼠单核-巨噬细胞中MANF敲除会增加脾脏中M2型巨噬细的数量肝纤维化情况下,通过免疫组化和荧光定量PCR的方法检测两组小鼠肝纤维化情况下脾脏M1型和M2型巨噬细胞的数量,结果表明肝纤维化情况下MφMANF-小鼠的脾脏中M2型巨噬细胞增多,而M1型巨噬细胞数量没有明显变化。结论1.正常情况下,单核-巨噬细胞中MANF敲除会增加M1型巨噬细胞的数量。2.肝纤维化情况下,单核-巨噬细胞中MANF敲除可引起更为明显的脾脏肿大,并且会增加脾脏中M2型巨噬细胞和浆细胞增多。