青岛文昌鱼COMMD6基因的克隆、表达和功能分析

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COMMD蛋白是最近发现的一类蛋白家族,因其羧基端具有高度保守的独特结构域COMMD(copper metabolism gene MURR1 domain)而命名,该结构域含有70-85个氨基酸。该家族目前有十个成员,COMMD1-COMMD10。目前除了COMMD1以外,我们对其他COMMD的生化特征及功能了解的都很少,尤其是在低等生物中。文昌鱼是现存的与脊椎动物原始祖先最接近的头索动物,一直被认为是研究脊椎动物起源和进化的模式动物。文昌鱼基因的序列和表达模式已经被广泛用于不同物种之间的比较基因组学研究和发育同源性分析。佛罗里达文昌鱼基因组的测序完成,为文昌鱼的研究奠定了坚实的基础。本文从青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)消化道cDNA文库中,分离得到具有完整编码框的BbCOMMD6,并对其结构、进化、表达和功能进行了研究。 从青岛文昌鱼cDNA文库中克隆到全长为1073 bp的BbCOMMD6 cDNA,其最大开放阅读框为612 bp,编码203个氨基酸的蛋白质,预测其分子量为23kDa。该cDNA编码蛋白BbCOMMD6的羧基端具有COMMD结构域(116-201位残基),氨基端比较长。将BbCOMMD6同其他物种的COMMD6蛋白的结构域进行同源性比对发现,BbCOMMD6与人,猩猩,家鼠,狗,牛,爪蟾,斑马鱼,海胆,霉菌的COMMD6分别有47.0%,45.3%,44.7%,44.2%,45.8%,43.5%,54.7%,50.0%和44.4%的同源性。BbCOMMD6的氨基端含有115个氨基酸残基,与爪蟾,斑马鱼,海胆的COMMD6氨基端长度差不多,并且与之分别具有28.2%,27.9%和40.9%的同源性,而哺乳动物COMMD6的氨基端非常短。利用BbCOMMD6与其他典型物种的COMMD蛋白的结构域序列进行系统进化树分析发现BbCOMMD6与其他物种的COMMD6聚为一支,而与其他COMMD蛋白明显分开。 构建包含BbCOMMD6完整阅读框和pET30a5’标签的表达载体,转化大肠杆菌,诱导表达及纯化重组蛋白BbCOMMD6。SDS-PAGE结果显示,当上样缓冲液中存在β-巯基乙醇时,BbCOMMD6只形成一条约28 kDa的带;而没有β-巯基乙醇时,形成两条带,大小分别为28 kDa和55 kDa。这说明重组蛋白BbCOMMD6是以单体和二聚体(通过二硫键形成)的形式存在的。将BbCOMMD6与CuCl2进行孵育后,进行native-PAGE和SDS-PAGE(上样缓冲液中无β-巯基乙醇)分析发现:Cu(II)并不能促进BbCOMMD6的二聚化。分别制备青岛文昌鱼的胞质蛋白和线粒体蛋白,然后利用自制BbCOMMD6抗体进行Western blot分析,结果表明BbCOMMD6主要存在于胞质中。蛋白质互作实验鉴定出一种与BbCOMMD6相互作用的蛋白,肌酸激酶(CK)。酶活力测定显示BbCOMMD6对肌型和脑型肌酸激酶的活性都有明显的抑制作用,并呈浓度依赖性。上述结果揭示了青岛文昌鱼COMMD6蛋白可能通过结合肌酸激酶,抑制其酶活力而间接参与能量转换。这也是对COMMD6参与调控肌酸激酶活性的首次报道。
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