论文部分内容阅读
目的: 1.利用大鼠四动脉阻断全脑缺血模型，探索在全脑缺血再灌注后经鼻给予天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1抑制剂Ⅳ（caspase-1 InhibitorⅣ，Boc-D-CMK; caspase-1抑制剂的一种）是否能减轻全脑缺血再灌注诱导的炎症。 2.利用大鼠四动脉阻断全脑缺血模型，探索在全脑缺血再灌注后经鼻给予Boc-D-CMK是否能减轻全脑缺血再灌注诱导的凋亡及神经元损伤。 3.利用大鼠四动脉阻断全脑缺血模型，探索在全脑缺血再灌注后经鼻给予Boc-D-CMK是否对全脑缺血再灌注诱导的功能损害有保护作用。 4.利用大鼠四动脉阻断全脑缺血模型，探讨caspase-1参与保护全脑缺血再灌注诱导的神经元损伤的可能机制。 方法: 1.清洁级健康SD大鼠6只，雄性，应用生物素标记的caspase-1抑制剂经鼻给药12小时后处死大鼠，利用共聚焦显微镜显像观察生物素标记的caspase-1抑制剂在脑内的分布情况。 2.清洁级健康SD大鼠12只，雄性，在大鼠四动脉结扎全脑缺血模型中，采用分光光度比色法检测缺血再灌注后不同时间点caspase-1的活性。 3.清洁级健康SD大鼠48只，雄性，随机分为三组:假手术对照组;缺血组;缺血+Boc-D-CMK组（治疗组）。采用大鼠四动脉结扎全脑缺血模型，应用免疫印迹、免疫组化研究蛋白表达量的变化，采用分光光度计比色法检测酶的活性，采用ELISA的方法检测炎症因子的分泌，利用免疫荧光和激光共聚焦技术观察蛋白的表达、神经元凋亡、神经元存活和线粒体的膜电势，采用焦油紫染色和TUNEL染色研究海马CA1区神经元细胞存活和凋亡，应用巴恩斯迷宫和新物体识别实验判断大鼠的学习记忆、记忆缺失等神经功能损害。 结果: 1、成年雄性SD大鼠海马CA1区caspase-1蛋白的表达 首先，我们观察了在不进行缺血的假手术大鼠海马CA1区caspase-1蛋白的基础表达。采用免疫荧光染色法检测caspase-1、微管相关蛋白(Microtubule associatedprotein-2，MAP2)和胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)显示了caspase-1在大鼠海马CA1区的表达，且结果发现caspase-1在海马CA1区与MAP2和GFAP共染，提示caspase-1在在大鼠脑内神经元和星形胶质细胞中表达。进一步研究发现，在全脑缺血再灌注后第三天和第十四天，caspase-1在海马CA1区星形胶质细胞存在明显的过表达。 2、生物素标记的caspase-1抑制剂经鼻给药后在中枢神经的分布 应用生物素标记的caspase-1抑制剂经鼻给药12小时后处死大鼠，取脑片常规处理后加入二抗，利用共聚焦显微镜显像观察了生物素标记的caspase-1抑制剂在脑内的分布，结果提示caspase-1抑制剂经鼻给药后可以渗入大鼠脑内，且证实药物可以分布在缺血敏感的海马CA1区，caspase-1抑制剂主要分布在海马和皮层神经元的细胞浆内。 3、经鼻给予caspase-1抑制剂Boc-D-CMK后处理可以抑制全脑缺血诱导的海马CA1区caspase-1的过表达和caspase-1的活性 首先该研究测定了大鼠全脑缺血再灌注后海马CA1区caspase-1活性的时间曲线。研究结果发现，与缺血前相比，在大鼠全脑缺血再灌注后所有时间点caspase-1活性均增加，大鼠全脑缺血再灌注后第3天前后达到高峰，第5天仍维持在较高水平。共聚焦显微镜观察发现经鼻给予Boc-D-CMK可明显抑制大鼠全脑缺血再灌注后第3天海马CA1区活化的caspase-1，且这种活化的caspase-1多在星形胶质细胞内表达。 4、经鼻给予caspase-1抑制剂Boc-D-CMK后处理可以改善全脑缺血诱导的海马CA1区神经元线粒体功能 经鼻给予Boc-D-CMK后处理能逆转全脑缺血诱导的海马CA1区神经元线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential，MMP)变化，能明显增加线粒体细胞色素C氧化酶活性，免疫印迹法结果分析进一步表明，Boc-D-CMK能减少全脑缺血诱导的海马CA1区神经元内细胞色素C从线粒体向细胞浆的释放，从而增加细胞色素C在线粒体的含量，可能减轻全脑缺血对神经元线粒体功能的损害。 5、经鼻给予caspase-1抑制剂Boc-D-CMK后处理可以抑制全脑缺血再灌注诱导的海马CA1区活化的caspase-9和活化的caspase-3的激活 共聚焦结果显示，在大鼠全脑缺血再灌注第3天，活化的caspase-9和活化的caspase-3的活性显著增加。通过双重免疫荧光染色研究表明，活化的caspase-9和活化的caspase-3与神经元特异性核蛋白(Peuronal-specific nuclear protein，NeuN)阳性细胞共染，而经鼻给予Boc-D-CMK后处理能明显减少共染的活化的caspase-9及活化的caspase-3的激活。 6、经鼻给予caspase-1抑制剂Boc-D-CMK后处理可以抑制全脑缺血再灌注诱导的海马CA1区的凋亡 免疫荧光染色显示，在全脑缺血再灌注后第3天，全脑缺血再灌注诱导海马CA1区细胞层TUNEL阳性细胞数和聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶(Poly ADP-ribose polymerase，PARP1)阳性细胞数明显增加，而经鼻给予Boc-D-CMK后处理能显著减少TUNEL阳性细胞数和PARP1阳性细胞数的增加。 7、经鼻给予caspase-1抑制剂Boc-D-CMK后处理能减少全脑缺血诱导的海马CA1区小胶质细胞的激活和星形胶质细胞的活化 首先，Western blotting检测结果显示，在全脑缺血再灌注后第3天，海马CA1区离子钙接头蛋白抗体（Ionized calcium-binding adaptor molecule-1，Iba1）和GFAP含量与假手术对照组相比明显增加，表明在全脑缺血再灌注早期阶段即诱导胶质细胞增生，而经鼻给予Boc-D-CMK后处理可明显降低Iba1和GFAP的增加。共聚焦显微镜结果提示，在全脑缺血再灌注后第14天，缺血再灌注诱导小胶质细胞和星形胶质细胞激活，经鼻给予Boc-D-CMK后处理可抑制小胶质细胞和星形胶质细胞激活或活化。 8、经鼻给予caspase-1抑制剂Boc-D-CMK后处理可抑制海马CA1区全脑缺血再灌注诱导的炎性细胞因子的产生和减少神经元死亡 在全脑缺血再灌注后第3天，海马CA1区炎性细胞因子IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α分泌显著增加，经鼻给予Boc-D-CMK后处理明显抑制了海马CA1区炎性细胞因子的产生。通过焦油紫染色、NeuN染色共聚焦显微镜显像进行的组织学评价，证实全脑缺血再灌注可诱导缺血易损的海马CA1区局部神经元死亡，经鼻给予Boc-D-CMK后处理显著增加全脑缺血再灌注后第14天海马CA1区神经元存活数量。 9、经鼻给予caspase-1抑制剂Boc-D-CMK后处理能改善大鼠全脑缺血再灌注诱导的空间学习记忆能力障碍，能显著增强缺血后大鼠的新物体识别的长程记忆能力。 应用巴恩斯迷宫评估大鼠海马依赖的空间学习和记忆能力发现，全脑缺血再灌注后大鼠定位到目标逃离暗箱的时间明显延长，并且在探索阶段测试中，在目标逃离暗箱所在四分之一象限停留的时间缩短，而经鼻给予Boc-D-CMK后处理能改善大鼠空间学习与记忆能力。由于海马的完整性还与如新物体识别记忆能力的非空间的学习记忆能力有关，本研究应用新物体识别试验评估各组大鼠，发现全脑缺血再灌注后的大鼠对新物体的识别指数降低，经鼻给予Boc-D-CMK后处理能改善大鼠新物体识别能力的下降。 结论: 1.经鼻给予的Boc-D-CMK能进入中枢神经系统，随后发挥抑制caspase-1的活性，降低神经元线粒体的功能损害，抑制缺血易损的海马CA1区活化的caspase-3、活化的caspase-9和凋亡，能增加神经元的存活数量。 2.经鼻给予的Boc-D-CMK改善大鼠全脑缺血导致的学习记忆障碍、长程识别能力下降。 3.进一步的研究表明，经鼻给予Boc-D-CMK发挥神经保护作用的可能机制如下:抑制过度胶质活化、抑制下游促炎因子减轻神经炎症的反应、显著增加海马CA1区NeuN-阳性细胞数而减少TUNEL-阳性细胞数和PARP1-阳性细胞数。 总之，本研究表明，经鼻给予caspase-1抑制剂Boc-D-CMK能通过调节抗炎和抗凋亡的作用以减少大鼠全脑缺血后海马CA1区的神经细胞死亡，使其功能损害得以改善。该研究提示，抑制caspase-1可能是治疗短暂全脑缺血后神经损伤和功能障碍的很有前途、前景的治疗策略。