目的：　　肾细胞癌是最常见的肾脏恶性肿瘤。肾癌早期无症状，出现症状时，约有60％的患者发生了难以预料的转移。目前，根治性肾癌切除术是治疗的主要手段，但手术仅能治疗早期患者，对大部分肾癌患者并不能达到“根治”的目标。肾癌对放疗和化疗均不敏感，以往的病例对照研究显示放、化疗及激素治疗均不能阻止肾癌的临床过程。近年来的研究发现，肾癌是一种免疫原性很强的肿瘤，免疫治疗对肾癌有其独特的优势。而肿瘤特异性主动免疫治疗是一种激发机体特异性抗肿瘤免疫反应的策略，是最具前景的肾癌治疗手段。树突状细胞(dendritic cell, DC)瘤苗是国内外肿瘤特异性主动免疫治疗研究和应用的前沿和焦点。DC是目前已知的功能最强大的专职抗原递呈细胞(antigen presenting cell，APC)，也是唯一能激活初始型T细胞的APC。DC的抗原递呈功能是DC瘤苗抗肿瘤免疫治疗的基础。而DC瘤苗尚需完善的关键环节是如何成功地进行DC瘤苗的体外肿瘤抗原负载。热休克蛋白70(heat-shock proteins70，HSP70)是细胞质中的一种“分子伴侣”(molecular chaperones)，其基因组成及氨基酸序列具有高度保守性，同种间不具多态性，在肿瘤细胞内有较高的表达，具有“伴移抗原肽”（chaperone antigenicpeptides）作用，其本身虽不是肿瘤抗原，但作为一种载体，结合多种肿瘤抗原肽（抗原决定簇），从肿瘤组织中提取的HSP70，实际上，是结合了肿瘤肽库的热休克蛋白70-肽复合物（heat-shock proteins70-peptide complexes，HSP70-PC）。如果我们从肾癌中提取具有黑箱概念的HSP70-PC做为肾癌的肿瘤抗原，进行DC的体外抗原负载，即能改善肿瘤患者DC功能的不足，又避免了全细胞性抗原等的负面作用，必将获得更好的治疗效果，具有良好的应用前景。同时，由于HSP70同种间不具多态性，同种肿瘤可能存在相同肿瘤抗原，从肾癌组织或细胞株中提取的HSP70-PC可用于那些不能手术、无法获取肿瘤抗原的晚期患者，使他们能够进行DC疗法治疗，最大程度地延长患者生存期和生存质量。定会带来巨大的经济和社会效益，意义重大。　　方法：　　1、DC的体外培养　　采集自愿者外周静脉肝素钠抗凝血，经Ficoll-Paque Plus密度梯度离心获得PBMC，用PBS液洗涤二次，悬浮于AIM-V无血清培养基中，调整细胞浓度在5×106/ml，在37℃，5％CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养，2h后去除悬浮细胞，贴壁细胞加入含有1000 u/ml GM-CSF和1000 u/ml IL-4的AIM-V无血清培养基中继续培养，第2d、第5d补加细胞因子，于第7d加入肿瘤抗原，第8d收获DC，流式细胞仪检测DC表面成熟标志CD83、CD80、CD86、HLA-DR的表达，并进行接续的实验。　　2、HSP70-PC的层析分离及鉴定　　将肾癌组织细胞置于约4倍体积的低渗缓冲液（30mM NaHCO3，pH7.2）中超声破碎，20，000 rpm高速离心2h，取上清过Con A-Sephrose柱，收集未结合组分，PD-10柱更换缓冲液A(20 mM Tris-HCL，20 mM NaCl，15 mMβ-巯基乙醇，3mMMgCl2，pH7.5)，然后将样品加到ADP-agarose柱上，结合部分用含有3mMADP的缓冲液A进行洗脱，将洗脱液用PD-10柱更换为缓冲液B(20 mM Tris-HCl，20mM NaCl，pH7.5)，再加于DEAE纤维素柱，用FPLC系统进行分离，20～500 mM梯度NaCl洗脱。将各色谱柱分离的样品及DEAE纤维素柱的各段洗脱峰样品在10％SDS-PAGE上进行蛋白质分子量及纯度测定，电泳后进行考马斯亮蓝染色，或转印至硝酸纤维素膜上，进行免疫印迹(Western blot)分析。BCA试剂盒测定蛋白浓度。　　3、肾癌组织的原代培养　　肾细胞癌肿瘤标本置DMEM培养基（含1％青霉素/链霉素，1％两性霉素，0.5％谷氨酰胺，20％胎牛血清）。用不同的原代组织培养方法培养。1～2代以后部分细胞用细胞冻存液保存于液氮中。杀瘤实验以第3代传代细胞为靶细胞。　　4、HSP70-PC致敏DC与自体T细胞共培养　　外周静脉抗凝血经Ficoll-Paque Plus密度梯度离心获得PBMC后，在CO2细胞培养箱中经2h静止后倾出的悬浮细胞，离心，加入细胞冻存液，调整细胞浓度1.0×107/ml，-80℃冻存。第7d复苏，分装培养瓶，按1∶10的比例分别加入HSP70-PC等不同组别致敏DC细胞，3d后收集细胞。　　5、T细胞杀瘤活性检测　　用自体原代培养的肾癌细胞为靶细胞，共培养3d的T细胞为效应细胞，效靶比20∶1，孵育24 h后用CCK-8试剂盒进行CTL杀瘤活性检测。　　结果：　　1、DC的体外培养　　贴壁的PBMC经加入含GM-CSF、IL-4的无血清培养基培养1d后开始出现少数细胞悬浮生长。第3d细胞出现不规则形态，悬浮细胞增多。第5d细胞表面伸出毛刺样突起，数量增多，体积增大，成簇生长。第7d大部分细胞悬浮并聚集成簇，外形不规则，体积为原来的1～2倍，具有典型的树突状突起。外周血单个核细胞，经GM-CSF、IL-4诱导可大致获得5～10％PBMC数量的DC。加入肿瘤裂解物抗原及诱导成熟因子或加入自体或异体的HSP70-PC后，DC表面成熟标志CD83、CD80、CD86、HLA-DR的表达明显增加。　　2、HSP70-PC的纯化及鉴定　　经过二次亲和层析和DEAE纤维素柱的分离后，得到纯度较高的分子量约为70 kDa的蛋白质，经免疫印迹分析证实该蛋白质即为HSP70。经BCA法测定溶液中HSP70-PC浓度计算，大约每1 g肿瘤组织细胞可获得20～100μg的HSP70-PC。HSP70-PC体外致敏DC无需再加入促DC成熟的细胞因子，就能使DC表面成熟标志CD83、CD80、CD86、HLA-DR的表达增加，具有更好的活化DC的能力。　　3、肾癌组织的原代培养　　8例肾癌患者切除的肿瘤标本经不同原代培养方法均成功分离出肾癌细胞并能传代培养及复苏。混合酶消化法结合差速贴壁分离法是较适合的肾癌原代培养方法。这些原代培养细胞足够用于体外CTL特异性杀瘤试验的检测。最终用于检测杀瘤实验的5例。　　4、抗原致敏DC诱导的CTL杀瘤活性　　原代培养肾癌细胞患者自体抗原致敏DC诱导的CTL杀伤实验结果显示，HSP70-PC致敏DC组所诱导的CTL具有更高的杀伤自体肿瘤的能力。4种效应细胞组（T细胞）杀伤率从低至高依次为:未经DC诱导组、无抗原致敏DC组、肿瘤细胞提取物抗原致敏DC组、HSP70-PC致敏DC组，各组间杀伤率相关性分析显示，各组间差异均显著(P＜0.01)，各组之间杀伤率比较具有正相关关系。原代培养肾癌细胞患者用异体抗原（肾癌769-P细胞株HSP70-PC）致敏DC诱导的CTL杀伤实验结果显示，异体HSP70-PC致敏的DC也较无肿瘤细胞提取物抗原致敏的DC所诱导的CTL具有更高的杀伤肿瘤的能力。原代培养肾癌细胞患者自体HSP70-PC致敏DC诱导的CTL与原代培养肾癌细胞患者异体HSP70-PC抗原致敏的DC诱导的CTL杀瘤活性比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。　　结论：　　(1)从外周血单个核细胞中能够成功分离、扩增出树突状细胞。在体外培养中，肾癌细胞裂解物抗原体外致敏外周血单个核细胞来源的DC需要促DC成熟细胞因子的辅助诱导才能使DC成熟。　　(2)应用色谱分离法可以有效地提取纯度较高的HSP70-PC。提纯的HSP70-PC有较好的体外致敏DC的能力，诱导DC后不需要TNF-α等促DC成熟因子的辅助即可使DC成熟。　　(3) HSP70-PC作为DC的致敏抗原可有效激活诱导CTL。具有较强的杀肿瘤活性。同种异体肿瘤中纯化的HSP70-PC可致敏DC且能有效诱导激活具有较强杀肿瘤活性的CTL。